文献阅读-自噬调节烟草花粉管的正常萌发
？在前期烟草自噬基因的鉴定中，作者发现与自噬相关的ATGs在花粉萌发期表达量大幅增加，在成熟花粉中达到最大值，提示自噬可能参与植物的正常生长发育。所以作者想以烟草为模型来探究是否是这样。
？幸运的是，作者通过各种手段发现花粉萌发过程中自噬活性大大增强。萌发后30分钟，透射电镜观察到自噬体。当使用Con A(伴刀豆球蛋白A，它可以酸化液泡并防止自噬体降解)时，发现自噬体富集在萌发孔附近的液泡中。光学显微镜下用ATG8特异性抗体标记的自噬体进行免疫分析，发现自噬体在萌发孔处有明显的点状聚集。RT-QCPR还显示，自噬相关基因在萌发后1小时大部分表达上调，然后下调，提示自噬参与了花粉萌发过程。
？为了证明自噬真的参与了花粉萌发的过程，杀了他。于是他们用自噬抑制剂3-MA，也就是磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K)抑制剂来处理花粉体外萌发。发现用抑制剂处理过的花粉发芽不多。而且发芽的抑制剂处理有剂量效应(定性实验)。随后，用ATG8抗体标记自噬体，发现加入3-MA后，自噬体的形成确实减少了(约70%)(定量实验)。到目前为止，可以说自噬确实参与了花粉萌发的过程。
？为了进一步探索自噬在花粉萌发过程中的作用，作者比较了正常花粉萌发和3-MA处理的花粉萌发。发现在3-MA处理的过程中，萌发孔的附着会形成一种凸起的细胞质结构，与其他细胞质有明显的区别。作者认为自噬活动主要是去除这种突出的细胞质结构。
？在以前的研究中，已经知道自噬活性与ATG家族基因有关，因此作者开始探索其机制。于是作者筛选了三个单拷贝的ATG2、ATG5和ATG7基因(不是PtdIns3K复合体)分别构建了RNAi载体。发现ATG2、ATG5和ATG7(附件中)的下调确实引起了花粉萌发率的下降，这与3-MA处理的表型相似。并且ATGs下调不会导致花粉活力下降，但只有30%-50%左右的花粉能够萌发。
？接下来工作的重点无疑是探索ATGs引起的花粉萌发失败与自噬之间的关系。通过使用ATG8和ATG13作为Western blot的报告基因，可以看出ATG8和ATG13在RNAi植物中的表达水平下调，提示当其中一个基因下调时，自噬水平也会下调。免疫荧光检测发现，RNAi植株中自噬体的数量明显减少。为了区分自噬体的减少是导致减少还是快速降解，Con A不能将自噬体的数量恢复到野生型水平，这表明ATGs参与了自噬体的形成。使用crispr突变体atg5。进一步说明自噬体的形成确实存在问题。
？为了进一步探讨自噬体的形成与ATG之间的关系，作者分析了ATG8的肥胖程度，因为它对自噬体的形成至关重要。从WT和ATGs-RNAi的花粉中收集所有的膜组分，然后在PLD(磷脂酶D)预处理之前或之后通过蛋白质印迹分析测定ATG8的脂质化。SDS-PAGE后，在western blot中通常检测到ATG8–PE的迁移带，比at G8的迁移带快。可以看出，野生型在治疗后跑得更快，这证明它们在G8被脂质化。然而，在ATGs-RNAi植物中，ATG脂质化程度下降到一般水平。在ATGs-RNAi植物中，还发现萌发孔处有凸起的细胞质层，并对其面积进行了量化。
为了探索花粉萌发早期自噬与脂质的关系，采用液相色谱-质谱联用技术对野生型和ATG RNAi植物的花粉进行了分析。在野生型和ATG沉默花粉中鉴定和定量了几种鞘脂、磷脂和甘油酯。潜在结构的正交投影-判别分析(OPLS-DA)显示野生型和ATG_RNAi品系之间存在明显的分离，表明各ATG RNAi品系的脂质组成存在明显差异。然后，详细分析了参与自噬的脂质。磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱三种磷脂参与自噬体的形成，其中PI在自噬体成核过程中可被VPS34磷酸化形成PtdIns3K，在RNAi植物中的表达水平大大降低。此外，在ATGs_RNAi的花粉中，囊泡成核和吞噬细胞扩增分别必需的PE和磷脂酰胆碱的表达水平也下降，并伴有一些溶酶体和溶血磷脂酰胆碱的增加。
此外，在哺乳动物中，鞘脂的外源神经酰胺(Cer)可以通过抑制氨基酸摄取和诱导BECN1/Beclin1的表达，即酵母VPS30/ATG6的哺乳动物直向同源物，来激活自噬。有趣的是，ATGs_RNAi花粉中的Cer水平显著高于野生型。磷脂心磷脂(CL)从线粒体内部重新分配到线粒体外部，对于受损线粒体的自噬非常重要。与野生型相比，氯在RNAi植物花粉中的积累水平较高。磷脂酰甘油(CL合成的重要底物)也在ATGs_RNAi的花粉中积累。同样，与WT相比，ATGs_RNAi的花粉中溶血磷脂酰甘油(合成磷脂酰甘油的前体)的水平也增加了。三酰甘油(TAG)是许多植物花粉粒中储存在脂质体中的主要成分。抑制自噬可能导致植物和哺乳动物体内脂质的增加。因此，作者重点研究了TAG和二酰甘油(TAG合成中的中间代谢产物DAG)的组成。在ATGs_RNAi中观察到大量TAG和DAG的积累。有趣的是，一种新的两亲性脂质亚类，ω-羟基脂肪酸，也在自噬缺陷型花粉中积累了高水平。以上研究表明，自噬引起的膜成分变化保证了花粉的正常萌发。
最后，作者利用串联质谱(TMT)进行定量质谱分析，探讨ATG2和ATG5下游蛋白表达的变化。其中，4.3%和2.8%在ATG2-和ATG 5-silent poll中上调，2.6%和2.8%下调。因此，作者认为自噬途径在花粉蛋白质组中起着重要的作用。而且ATG2_RNAi和ATG5_RNAi中的up和down有很多重叠，可能调控同一条通路。但GO分析表明，ATG2主要富集与核糖体蛋白和核糖核蛋白相关的成分，ATG5富集与肽酶和蛋白酶体相关的成分，表明了它们的功能差异。在细胞成分方面，我们可以发现线粒体质子转运ATP合酶复合物相关蛋白明显下调，细胞膜成分明显上调。在生物过程中，下调蛋白富集于细胞氮化合物的生物合成和ATP合成与质子转运的偶联，而上调蛋白富集于小GTP酶介导的信号转导。因此，作者认为ATG2和ATG5主要通过线粒体ATP和蛋白质的合成来影响花粉萌发。为了证实这一结果，作者还鉴定了富集的途径，发现上调和下调的蛋白都被归类为与氧化磷酸化相关的途径。
本文揭示了自噬是如何参与花粉萌发过程的，并揭示了其对脂质成分和下游蛋白的影响。但是，这些ATG蛋白似乎在花粉萌发过程中发挥了作用，这似乎是多余的，但每个RNAi植物都有一个表型，这让我觉得很奇怪。如果能做双突变或者三突变就更好了。此外，在花粉萌发过程中表达发生变化的另一个ATG的功能是什么？需要进一步挖掘。