高效液相色谱的经验
特性
1.高压:液相色谱以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到的阻力很大。为了快速通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可以达到150 ~ 350× 105 Pa。
2.高速:柱内流动相流速比经典色谱快得多，一般可达1 ~ 10 ml/min。高效液相色谱所需的分析时间比经典液相色谱少得多，一般小于1h。
3.高效:最近开发了很多新的固定相，大大提高了分离效率。
4.高灵敏度:高灵敏度检测器已广泛应用于高效液相色谱，进一步提高了分析的灵敏度。比如荧光检测器的灵敏度可以达到10-11g。此外，样品量少，通常为几微升。
5.适用范围广:气相色谱与高效液相色谱的比较:气相色谱虽然具有分离能力好、灵敏度高、分析速度快、操作方便等优点，但由于技术条件限制，很难用气相色谱分析沸点过高或热稳定性差的物质。而高效液相色谱只要求样品无需气化即可制成溶液，所以不受样品挥发性的限制。原则上可以用高效液相色谱法分离分析沸点高、热稳定性差、相对分子量大(400以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总量的75% ~ 80%)。据统计，在已知的化合物中，大约20%可以用气相色谱分析，70 ~ 80%可以用液相色谱分析。
根据其固定相的性质，高效液相色谱可分为高效凝胶色谱、疏水高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱和高效聚焦液相色谱。不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理与相应的普通液相色谱基本相似。不同的是，HPLC灵敏、快速、分辨率高、重复性好，而且必须在色谱仪中进行。
高效液相色谱的主要类型及其分离原理
根据分离机理的不同，HPLC可分为以下主要类型:
1.液-液分配色谱和化学键合相色谱。
流动相和固定相都是液体。流动相和固定相应互不相溶(极性不同，避免固定液流失)，并有明显的界面。当样品进入色谱柱时，溶质分布在两相之间。当达到平衡时，遵守以下公式:
其中CS是固定相中溶质浓度；cm——流动相中溶质的浓度；vs-固定相的体积；VM-流动相的体积。LLPC与GPC相似，即分离级数取决于K，K越大，组分的保留值越大。然而，也有不同之处。在广义预测控制中，流量对K的影响很小，而LLPC流量对K的影响很大..
A.正相液相色谱:流动相的极性小于固定相。
B.反相液相色谱:流动相的极性大于固定相。
C.液-液分配色谱的缺点:虽然流动相和固定相的极性要求完全不同，但固定相仍有少量溶出；流动相通过色谱柱时的机械冲击会造成固定液的损失。20世纪70年代末开发的化学键合固定相(见下文)可以克服上述缺点。现在广泛使用(70~80%)。
2.液-固色谱法
流动相为液体，固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等。).这种分离是根据物质吸附的不同而进行的。其机理是当样品进入色谱柱时，溶质分子(X)和溶剂分子(S)竞争吸附吸附剂表面的活性中心(不进样时，吸附剂的所有活性中心都吸附S)，可表示为:
Xm + nSa ====== Xa + nSm
其中:Xm -流动相中的溶质分子；Sa -固定相中的溶剂分子；Xa -固定相中的溶质分子；Sm -流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达到平衡时:
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
其中:k是吸附平衡常数。【讨论:k越大，保留值越大。]
3.离子交换色谱法
IEC使用离子交换剂作为固定相。IEC基于离子交换树脂上的可电离离子和流动相中带相同电荷的溶质离子之间的可逆交换，这些离子根据它们与交换剂的不同亲和力而被分离。
以阴离子交换器为例，交换过程可表述如下:
X-(在溶剂中)+(树脂-r4n+cl-) = =(树脂-R4N+ X-)+Cl-(在溶剂中)
当交换达到平衡时:
KX =[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]
分配系数为:
DX =[-R4N+X-]/[X-]= KX[-R4N+Cl-]/[Cl-]
[讨论:DX和保留值之间的关系]
任何可以在溶剂中电离的物质通常都可以用离子交换色谱法分离。
4.离子对色谱法
离子对色谱是在流动相或固定相中加入一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为抗衡离子或反离子)，使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。它的原理可以用下面的公式表示:
X+水相+Y-水相= = x+Y-有机相
其中:X+水相-流动相中待分离的有机离子(或阳离子)；Y-水相-流动相中带相反电荷的离子对(如四丁基氢氧化铵、十六烷基三甲基氢氧化铵等。);X+y形成的离子对化合物。
当达到平衡时:
KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相。
根据定义，分配系数为:
DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相。
[讨论:DX和保留值之间的关系]
离子对色谱(尤其是反相色谱)解决了过去难以分离的混合物的分离问题，如酸、碱、离子和非离子混合物，特别是一些生化样品如核酸、核苷、生物碱和药物。
5.离子色谱法
离子交换树脂用作固定相，电解质溶液用作流动相。为了消除流动相中强电解质背景离子的干扰，设置了抑制柱，以电导检测器为通用检测器。样品组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱相同。
以阴离子交换树脂(R-OH)为固定相分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时，发生如下交换反应(洗脱反应是交换反应的逆过程):
抑制色谱柱上的反应:
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
可以看出，洗脱液通过抑制柱转化为电导率非常小的水，消除了背景电导率的影响；样品中的阴离子Br-转化为相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏地检测。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。它也可用于阳离子分析。
6.空间排阻色谱法。
空间排阻色谱使用凝胶作为固定相。它类似于分子筛，但凝胶的孔径比分子筛大得多，通常在几纳米到几百纳米之间。溶质在两相之间的分离不是通过它们相互作用力的差异，而是通过分子大小。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积或分子大小有关。样品进入色谱柱后，随流动相在凝胶外和孔边的缝隙中流动。在样品中，一些太大的分子不能进入凝胶孔而被排除在外，所以它们直接通过色谱柱，首先出现在色谱图上，一些非常小的分子可以进入所有的凝胶孔并渗透到颗粒中。这些组分在色谱柱上具有最大的保留值，最终出现在色谱图上。
气相色谱法是色谱法的一种。色谱中有两种相，一种是流动相，另一种是固定相。如果以液体为流动相，称为液相色谱，以气体为流动相，称为气相色谱。
由于使用的固定相不同，气相色谱可分为两种:以固体吸附剂为固定相的气固色谱和以涂有固定液的载体为固定相的气液色谱。
根据色谱分离的原理，气相色谱还可分为吸附色谱和分配色谱。在气固色谱中，固定相是吸附剂，气固色谱属于吸附色谱，气液色谱属于分配色谱。
气相色谱按色谱操作形式属于柱色谱，按所用色谱柱的粗细可分为一般填充柱和毛细管柱。固定相一般装在内径2 ~ 6mm的玻璃或金属管中。毛细管柱可分为中空毛细管柱和填充毛细管柱。中空毛细管柱是将固定液直接涂在内径仅为0.1 ~ 0.5 mm的玻璃或金属毛细管内壁上，而填充毛细管柱是近年来发展起来的。它是将一些多孔固体颗粒填充到厚壁玻璃管中，然后加热拉伸制成内径一般为0.25 ~ 0.5 mm的毛细管。