WB内参曝光但目标基因带空白——个人经验丰富！

今天天气非常冷。我没有像昨天那样睡得很晚，只是起得很早。

因为我有一些最后的实验要完成，然后告别实验室大约两个月。有点伤感，回顾这两个月在实验室成长的点点滴滴，有过辛苦的汗水，有过失败的苦恼，也有过成功的喜悦...

刚掌握了一些实验技能，就要无情的离开，真的有点难过。毕竟等我回到这里，这些技能都可能还回来。

反正这只是暂时的告别，只是为了整理之前的数据，然后更好的设计和规划后续的实验。

到了实验室，我们完成了最后一波免疫组化的后续部分。继续完成昨天洗脱的WB(这个洗脱液效果不错。但是成绩并没有太大的提升。一个新的发现是曝光时间。这次我按照说明书的图例把曝光时间调到600秒，居然爆发了。)

鉴于昨天的问题——WB内参用完了，但目的基因带是空白的，今天我来回答一下。

1，一级阻力和二级阻力混淆了吗？

答:结合两次实验的结果，说明我没有混淆一抗和二抗的种类。

2.胶水切错了，导致目标条缺失？

回答:切胶没问题，切内参带有问题。抗体说明书分子量为36KD，实际分子量为39KD。

3.组织蛋白表达太少？

答:这是最有可能的。目前我的WB蛋白是30ug，可以考虑进一步用50ug左右。

4.因为目标蛋白是催化酶，不使用相关蛋白酶抑制剂(如cokertail等)会不会导致蛋白丢失。)?

答:蛋白酶抑制剂PMSF效果还可以，以后有条件可以考虑其他蛋白酶抑制剂。

5.蛋白质(两周前)存放时间太长，蛋白质降解？

答:也可能有这个因素，导致蛋白质消耗减少。建议尽快完成蛋白质提取。

6.膜转移时间(300mA，2h)过长，导致蛋白质透过膜。

答:有两种目标蛋白。今天一个蛋白(64KD)被我曝光，另一个蛋白(52KD)一直空白。高度怀疑膜转移导致蛋白质丢失。参考别人的建议，转片条件可以设置为:200mA，1min /1KD。

7.电泳液用的时间太长(我懒得用别人的电泳液——十天前跑了一次)？

答:实践表明影响不是特别大，可能会影响膜上蛋白质的均一性。

8.曝光时间太短？

答:对于表达量非常低的蛋白质，建议延长暴露时间。比如今天我把曝光时间设为500秒，300秒才看到条纹。虽然很弱，但我也找到了结果，对问题消除带来了很大的帮助。

补充两个问题:

9.抗体浓度有问题吗？可能太低了。能改善吗？

答:对于52KD蛋白，我把浓度提高了一倍，但还是没有暴露。所以对于WB白片来说，这个浓度的影响力应该排在比较靠后的位置。

10，曝光液的感光度？

答:这是关键因素之一。第二次运行，在蛋白含量不变的情况下，我控制了转膜时间，不到90分钟，制备了新鲜抗体，使用了超敏感的ECL暴露液(第一次只使用了增强型ECL暴露液)，这次效果特别好。所以我建议用超感光曝光液。

是时候说再见了，但我相信这不是永远！