药物合成纸
第二章基因工程制药
第一节概述
第二节基因工程药物的生产过程
第三节目标基因的获取
第四节基因表达
第五节基因工程菌的生长和代谢特征
第六节基因工程菌的稳定性
第七节基因工程菌的中试
第八节基因工程菌的培养
第九节高密度发酵
第十节基因工程药物的分离与纯化
第11节变性蛋白质的复性
第十二节基因工程药物的质量控制
第十三节基因工程菌药物的制造实例
第一节概述
基因工程在药学中作用
基因工程药物的主要类别
基因工程生产药物的优势
国内外基因工程药物发展简介
与国外先进水平的差距
基因工程药物的主要类别
1.激素:胰岛素、生长激素
2.免疫蛋白:单克隆抗体、疫苗
3.细胞因子:干扰素、白介素
4.酶:尿激酶、超氧化物歧化酶
基因工程生产药物的优势
1.收获巨大，更有效的服务社会。
2.生产效率更高
3.进一步提高药理活性，例如:蛋白质工程。
4.促进新药的获得:筛选新化合物
5..？
基因工程(基因工程):
有意识地将一个生物体内有用的目的基因转移到另一个生物体内，使后者获得新的遗传性状或表达所需的产物。
稀有珍贵的蛋白质药物
1982年，美国美国食品药品监督管理局批准了第一个基因工程产品——人胰岛素——这标志着基因工程产品正式商业化。
人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、干扰素-A、纤维素酶、抗血友病因子、促红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等。
畜牧业应用
动物疫苗、生长激素等。
例:tPA，一种治疗心脏病的药物，是从转基因羊的羊奶中提取的。
在种植业中的应用
用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体培养分化为愈伤组织，最终发育成具有新特征的完整植株——转基因植株。
在种植业中的应用
化学除草剂抗性基因
转基因番茄
固氮酶基因
人类DNA
……
环保等等。
第2+3节
重组DNA技术
1重组DNA技术是基因工程的核心技术。
2.获得所需的目标基因(外源基因)
3.重组质粒的构建及基因克隆
转化受体细胞和转化体的筛选
5个转化子的分析-Southern杂交
重组DNA技术的突破导致了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高科技产业。
重组DNA技术，又称基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。这项技术包括一系列分子生物学操作步骤。
1重组DNA技术是基因工程的核心技术。
重组DNA操作的一般步骤:
(1)获得目的基因；
(2)与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；
(3)用重组DNA分子转化受体细胞，并在受体细胞中复制和遗传；
(4)筛选和鉴定转化子；
(5)培养具有外源基因的细胞或生物，以获得所需的遗传性状或表达所需的产物。
(1)构建一个基因文库，然后从中调用目标基因；
(2)以mRNA为模板，利用逆转录合成互补的DNA片段；
(3)目的基因片段的PCR扩增。
(4)旧基因的修饰
(5)化学合成(短)基因
2.获得目的基因的基本方法
细胞内总DNA的提取分离及基因文库的构建
细胞总DNA的提取和分离方法
基因文库的构建
将总DNA中包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，构成生物的基因文库。
通过逆转录合成互补DNA
构建基因库获取目的基因的问题—
花时间和麻烦。
内含子序列
通过逆转录合成互补DNA的优势—
获得的DNA片段往往是具有特定功能的靶基因。
聚合酶链式反应
PCR技术是在体外通过酶促反应选择性扩增(包括分离)一段目的基因的技术。
添加四种物质:
(1)作为模板的DNA序列；
(2)与分离的靶基因的两条链的5’末端序列互补的DNA引物(约20个碱基的短DNA单链);
(3)TaqDNA聚合酶；
(4)dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)。
聚合酶链式反应
变性、退火和延伸三部曲
变性:双链DNA融化成单链DNA。
退火:一些引物与模板单链DNA的特异性互补部分配对结合。
延伸:以目标基因为模板合成互补的新DNA链。
聚合酶链式反应
每一轮聚合酶链式反应都能使目标基因片段加倍。
30个循环后，可获得-230 (1.07× 109)个基因片段。
获得目基因的基本方法(续)
4.改造旧基因-蛋白质项目
5.(短)基因的化学合成
基因重组和克隆最重要的工具是限制酶、载体和宿主细菌。
必须克隆少量目的基因以获得大量拷贝，然后才能实现进一步的重组、转化和表达。
3.重组质粒的构建及基因克隆
限制性内切酶
限制性内切酶是从细菌中分离纯化的一种内切酶，能够识别并切割核酸序列的特定位点——分子手术刀。
Arber、Smith和Nathans因发现限制性内切酶的开创性工作获得了1978诺贝尔奖。
限制性内切酶
已经发现和鉴定了200多个物种
EcoRI特异性识别由GAATTC及其互补碱基组成的双链片段。
不愉快的结局
T4连接酶
载体
载体是将目的基因片段运输到宿主细胞中的工具。目前最常用的载体有细菌质粒、L噬菌体、粘粒质粒等。
质粒是一种环状DNA分子，天然存在于细菌细胞的染色体外，可以自主复制。进入宿主细胞的质粒可以大大增加其拷贝数。
A.质粒相对较小，可以插入较长的DNA片段。
B.进入宿主细菌细胞后，pUC18可以在每个细胞中复制形成约500个拷贝。
c在pUC18中有一段人工设计的带有各种限制性位点的短序列，即多克隆位点。
细菌质粒pUC18
pUC118质粒的多克隆位点被整合到lacZ基因中。如果没有外源目的基因插入该位点，lacZ基因可以表达。半乳糖苷酶，如果平板培养基含有IPTG和X-gal，X-gal会？半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色克隆。
将外源目的基因插入多个克隆位点，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色克隆。
D.lacZ基因插入失活筛选重组质粒。
E puc 18还携带氨苄青霉素抗性基因，可用于重组质粒的筛选。
乳糖(4-D-葡萄糖？-吡喃半乳糖苷)和别乳糖
以大肠杆菌为宿主菌的基因克隆
将目的基因克隆入大肠杆菌细胞的操作步骤:
a .获得目的基因和质粒载体；
b .形成重组质粒；
c .制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；
d .培养大肠杆菌，形成重组质粒和外源目的基因的大量拷贝；
e .筛选含有重组质粒的大肠杆菌细胞，检查或鉴定。
常见克隆基因的检测和鉴定方法
琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定不同大小的酶解片段:
磷酸基团带负电荷。
酶解片段向阳极移动。
电场驱动力和凝胶阻力
-不同的流动性
分子量标准参考
酶消化和电泳方法
32P标记的DNA分子探针
杂交
自动射线照相术
DNA杂交的直接鉴定
基因克隆获得大量目的基因后，需要在合适的宿主细胞中表达，产生所需的基因表达产物或使宿主生物具有所需的特性，同时目的基因能在宿主细胞中稳定遗传。这个过程就是基因转化。
如果克隆的基因需要表达和产生大量编码的蛋白质，可以培养转化的大肠杆菌来表达和积累大量的目的基因。通过分离和纯化表达产物可以获得所需的产物。
通过DNA体外重组技术构建的重组质粒也可直接用于转化原核生物，如蓝藻或其他原生动物。
转化受体细胞和转化体的筛选
遗传转化的常用方法
载体转化-农杆菌介导的转化
直接基因转移
(1)高压电脉冲电刺激射孔
(2)基因枪法
(3)显微注射法
纪念发明家爱德华·南方
(1)提取总DNA
(2)酶解
(3)电泳
(4)转移到滤膜上
(5)变性和熔化
(6)DNA探针和杂交
(7)洗脱
(8)放射自显影术
(9)比较分析
5个转化子的分析-Southern杂交
Southern杂交分析的例子
A.体外DNA重组实验
B.用抗生素筛选转化细胞
c .培养突变细胞。
D.southern杂交结果表明外源目的基因已转入突变细胞。
1973期间，斯坦福大学科恩教授和加州大学博耶教授领导的研究团队几乎同时完成了体外DNA重组，开启了基因工程的大门。
第四节基因表达
宿主细胞的选择
基因在大肠杆菌中的表达
酵母中的基因表达
动物细胞中的基因表达
1.表达宿主细菌
宿主细胞必备条件:7分
基因表达宿主细菌可分为两类。
常见宿主细菌
1.原核细胞:3种。
2.真菌:2种
以上主机有什么特点？
第二，外源基因在大肠杆菌中的表达
1.大肠杆菌表达载体中真核基因的六个基本特性
2.两种表达载体-pbv 220 & amp；pET系统
3.影响目的基因表达的五个因素
4.真核基因在大肠杆菌中的三种表达形式
大肠杆菌表达载体的六个基本特性
1.独立复制子
2.多克隆位点
3.强启动子
4.强终结者
5.镇压者
6.Shine-Delgarno序列& amp八月
影响目的基因在大肠杆菌中表达的五个因素
1.基因剂量
2.表达效率
3.表达产物的稳定性:
a转录强度，B翻译效率(核糖体结合，SD序列，密码子偏好性)
4.宿主大肠杆菌的代谢负荷
5.工程菌的培养条件
真核基因在大肠杆菌中三种表达形式
1.融合蛋白
2.分泌表达
3.普通表达式
3.外源基因在酿酒酵母中的表达
1.承运人:
四个类别，YEp，YRp，YCp，YIp。
克隆载体和穿梭载体
表达载体:普通表达载体和精确表达载体。
2.影响目的基因在酵母中表达的因素
1.外源基因剂量
2.外源基因的表达效率
①启动子的来源
②终止符的有效性
③信号分泌的效率。
3.外源蛋白的糖基化
4.宿主菌株的影响
第五节基因工程菌株的生长和代谢
细胞生长与能量的关系
关键词:氧气供应/能量/副产品/细胞生长
细胞生长与前提供给的关系
关键词:先决条件/
基因工程菌株的不稳定性
菌株和质粒的稳定性
提高质粒稳定性的六种方法
第六节基因工程菌株的不稳定性
第七节基因工程菌株的中试
试点测试的目的
试点过程
第八节基因工程菌株的培养
1.基因工程菌株的培养(发酵)方式
基因工程菌发酵技术的七大要素
基因工程菌株的发酵设备
第九节高密度发酵
高密度:概念和功能
影响高密度发酵的因素
如何实现高密度发酵
建立分离纯化工艺的必要性
分离和纯化的基本步骤
分离纯化技术
1.如何选择合适的分离纯化工艺？
2.细胞破碎和固液分离
3.目标产物的分离和纯化
选择分离纯化工艺的依据
1.根据产品的表现形式。
2.根据分离单元之间的连接
3.根据分离纯化工艺的基本要求
第十节基因工程药物的分离与纯化
第11节变性蛋白质的复性
包涵体及其形成原因
夹杂物的分解和溶解
包涵体的复性方法
原材料的质量控制
培养过程中的质量控制
净化过程中的质量控制
目标产品的质量控制
1.产品识别
2.纯度分析
3.生物活性的测定
4.稳定性
5.产品一致性
产品的保存
第十二节基因工程药物的质量控制
干扰素-人干扰素α2b的制备
人粒细胞集落刺激因子
人白细胞介素2
第13节制造基因工程药物的例子