基因启动子甲基化变化的分子诊断毕业论文怎么写？

DNA甲基化是一种表观遗传修饰。它是DNA甲基转移酶(DNMT)利用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶(mC)的反应。在真核DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一经过化学修饰的碱基。CG二核苷酸是最重要的甲基化位点。它在基因组中分布不均匀，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化区域。在哺乳动物中，mC约占总c的2-7%，一般来说，DNA甲基化会抑制基因表达。DNA甲基化在维持染色体结构、X染色体失活、基因印记和肿瘤发生发展中起着重要作用。

CpG二核苷酸在人类基因组中的分布非常不均匀，但在基因组的某些片段中，CpG保持或高于正常概率，这些片段被称为CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域。大约60%的基因启动子含有CpG岛。CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中起着非常重要的作用。启动子区及其附近CpG岛上胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调控基因的表达，从而使相应的基因沉默，去甲基化可以恢复其表达。在生理条件下，DNA甲基化参与控制基因的时间和空间表达。当肿瘤发生时，肿瘤细胞的全基因组低甲基化是一个重要特征。与正常细胞相比，肿瘤细胞基因组甲基化程度仅为20-60%，并伴有局部基因的高甲基化，包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管生成抑制基因等。然而，目前研究方法的局限性限制了对DNA甲基化的广泛研究。

近年来，研究人员一直在探索检测单个或多个甲基化位点的定性和定量方法。然而，由于甲基化多态性区域的高密度，很难设计用于延伸反应的引物位置。焦磷酸测序技术作为一种新的序列分析技术，可以快速检测甲基化发生的频率，定性定量检测样品中的甲基化位点，为甲基化研究提供了一种新的途径。

原则上，焦磷酸测序是一种通过合成方法进行序列分析的方法。焦磷酸测序通过核苷酸与模板结合后释放的焦磷酸启动酶级联反应，使荧光素发光并检测。该技术已用于检测单核苷酸多态性(SNP)的基因型和单体型，以及细菌和病毒的鉴定和分型。这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm？软件上显示的峰高来自于序列分析的原始数据，通过峰高可以准确检测出混合DNA模板中的等位基因频率。

目前，在甲基化的研究中，许多关于甲基化定量分析的报道使用亚硫酸氢盐处理甲基化样品和混合PCR产物。

作为更正，主要原理是亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶在适当的实验条件下保持不变。因此，样品经亚硫酸氢盐处理后，再经PCR扩增，甲基化位点可视为C/T的SNP，其基因频率为0-100%。在这里，我们介绍一位使用焦磷酸测序的研究人员。

焦磷酸测序反应中同时检测到6个甲基化位点。该方法也可用于石蜡包埋组织，具有较高的重复性和准确性。选择谷胱甘肽-S-转移酶π(GSTP1)转录起始位点的CpG岛进行检测。这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的。然而，它在肿瘤样本中高度甲基化。PCR扩增出一个140bp的含有17甲基化多态性位点的片段，用4个测序引物对15位点进行了研究(表1)。测序引物通过在线SNP测序引物设计软件(焦磷酸测序AB)设计。一些甲基化多态性位点被最可能的碱基取代，以减少计算次数。然后人工检测测序引物可能的错配。此外，在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照，以扣除由测序引物、生物素标记的引物或模板引起的背景。

PCR引物设计与模板完全匹配，不覆盖任何甲基化多态性区域。使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样品或10 fmol纯化的PCR产物，10 pmol正向(5’-gtgattagtattgg-3’)和反向(5’-生物素-aacttaaaacccatc-3’)引物扩增GSTP1转录起始位点的基因片段，扩增片段长度为144bp。反应体系为60 mM Tris-SO4，pH 8.9 18 mm (NH4) 2SO4，1 mm MgSO4，200微米DNTPS，3 U铂Taq DNA高保真聚合酶，终体积50μL，PCR循环设置:95℃变性4分钟，然后重复95℃30秒，50℃45秒，72℃20秒。最后的延伸步骤在72℃下进行4分钟，并停止反应。PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96中进行。

在哺乳动物基因组中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中胞嘧啶的第五碳源。