【文献分享】烟草花冠细胞的单细胞
5438年6月+2022年10月，《新植物学家》在网上发布了韩国金相奎团队的名称。
对尖喙烟草细胞的单细胞RNA测序揭示了一个菌群场景的生物合成途径”。本研究通过绘制烟草花冠细胞的单细胞转录图谱，鉴定出3765个花冠细胞。通过比较3765细胞中不同基因的表达模式，确定了苄基丙酮(BA)合成途径中的关键基因:NaPAL4、Na4CL、NaPKS2/3、NaAFR。同时验证了BA主要在花冠细胞的表皮层合成，为了解烟草BA的合成与调控提供了新的认识。
本研究中，作者选取单细胞测序的样本为:花冠肢和喉杯(下图A)。然后选取三个时间点:ZT8，ZT12，ZT16+06。通过单细胞测序获得3756个细胞，其中，根据附表给出的参数:每个细胞的基因中位数(约1000)和reads map to genome(约30%)，个人认为单细胞测序数据质量一般。
根据UMAP的结果，可以看出可以分为10个集群(下图B)，三个不同时间点的集群分布差异不大(下图C)。下一步是注释每个集群。在这篇论文中，作者指出，由于花中缺乏相关的标记基因，作者首先通过从头获得每个簇的标记基因，然后根据标记基因对每个簇进行注释。其中，主要的标记基因有:聚类7(花粉:果胶酯酶基因、延伸家族和花粉过敏原)，聚类8(韧皮部/木质部:甜11/12，苏丹2；1)、簇0/3/4/5/9(表皮细胞:酮酰辅酶a合成酶、ECERIFERUM4、蜡酯合成酶/二酰甘油酰基转移酶1、脂转移蛋白、乙二醇-3-磷酸酰基转移酶6、角质合成酶样)(图D)、簇6(绿色组织:光系统I/II)、簇1/2(薄壁细胞:因为角质层合成相关的基因比较低，但是光合作用合成的基因比较高，如
接下来，笔者重点介绍了巴的合成。在corolla中，BA合成途径始于NaPAL4(下图A)。那么接下来就需要4CL/CNL酶了。下一步由NaPKS完成(烟草有四个成员1/2/3/4，但不确认是那个成员)。除了已知的PAL4，PKS不知道是哪个成员，4CL和AER都不清楚，也没有得到证实。因此，作者假设基于已知的PAL4，合成途径中的其他基因应该在单细胞水平上与PAL4有很强的相关性，或者patter的表达是一致的(这与研究基因和基因调控是一样的)。
因此，作者计算了单细胞测序鉴定的所有基因与PAL4的相关性(下图B)，并用已发表的RNA-seq数据做了同步双向验证。从结果来看，单细胞的结果与RNA-seq的结果一致，如相关性较高的4CL1基因，PKS2/3，AER1。然而，也有一些不一致之处。比如从相关分布来看，单细胞更集中，更符合正态分布(下图C)。而IFR3就大不一样了。
接着，作者开始验证4CL1、PKS2/3和AER1基因在BA合成中的作用。
下图是4CL1淘汰赛的结果。从VIGS敲除的角度来看，4CL1在花冠顶部和内部的表达量显著下降(a/b以下)，BA含量也显著下降(a/b以下)。代谢产物的类型是肉桂酸和香豆酸，而不是咖啡酸和阿魏酸。此外，作者还检查了在这个4CL1的敲除材料中，其他4CL成员没有受到影响。
然后，作者试图验证PKS2/3的功能。从PKS2/3的敲除材料可以看出，无论是顶部还是内部，BA的含量都明显降低(下面的a/b)。但由于PKS家族的高度相似性，PKS1/4在敲除材料中也有所下降。当时作者在4CL1的产物中加入PKS2和PKS3时，发现只在加入PKS2的反应物中鉴定出BA，而在PKS3中没有鉴定出BA(下图C)。说明基因PKS2在这个过程中起着关键作用，而且PKS2的相关性远远强于PKS3。
还测试了AER1在BA合成中的功能。同样，在AER1的敲除材料中，花冠顶部和内部的BA含量明显降低(a/b以下)。此外，在AER1的基因敲除植物中发现了一种新的苄叉丙酮化合物(下图C ),它是BA的非还原形式。而这种新化合物并不存在于野生型花冠的顶端(下图C)。
在证明了这四个基因在BA合成中的作用后(其实这四个基因的发现过程似乎不需要单细胞数据，普通的多组织RNA-seq似乎也能实现，毕竟这四个基因的RNA-seq的结果也包括在内)，作者开始利用单细胞数据探索这四个基因在不同细胞中的分布规律。然后发现在3756个细胞中，有1097个细胞含有这四个基因，这1097个细胞基本集中在0/3/4簇(下图A)。从四个基因在不同细胞中的表达模式可以清楚地发现，它们主要富集在0/3/4簇(以下b/c)。已知这三个簇是表皮细胞，因此有理由假设和猜测BA可能是在花冠的表皮细胞中合成的。
GFP定位信息也显示这些基因主要在表皮细胞中表达(下图)。
由于花冠中BA的合成受生物钟的调控，于是作者又看了这四个关键功能基因与生物钟节律的调控关系。从表达模式来看，这四个功能基因的表达随时间呈节律性变化(下图A)，与已知的节律基因(下图A)相似，BA含量的变化也是如此(下图A)。因为单细胞采样需要三个时间点，包括昼夜点。所以笔者也看了这四个基因在单细胞数据中的变化，可以清楚的看到，白天在12h有一个峰值(下图B)。然后，作者测定了BA和四个关键合成基因在花冠枝和花冠筒中的差异。从结合的内容可以看出，巴主要在肢。从表达来看，虽然PAL和4CL在试管中也有表达，但PKS2和AERA在试管中几乎不表达，再次证明了BA的合成位点(下图C)。