非洲马瘟病毒详解
它由10个大小不等的双链RNA片段组成，三个大的是L1 ~ L3，三个中的是M4 ~ M6，四个小的是S7 ~ S10，编码10个蛋白质(VP 1 ~ VP7和NS1，NS2)。内衣外壳由两个主要蛋白VP3和VP7以及三个次要蛋白VP1、VP4和VP6组成，其中VP6被认为是病毒dsRNA的解旋酶[2]。外壳由两种蛋白质组成，VP2和VP5，当病毒穿过细胞膜时，它们将被去除。此外，感染细胞中至少有三种非结构蛋白(NS1、NS2和NS3/3A)。该病毒有9种不同抗原性的血清型[3]。尽管在该领域没有发现型内变异的证据，但一般认为血清型之间存在一些交叉关系，尤其是AHSV-1和2、AHSV-3和7、AHSV-5和8以及AHSV-6和9。2.1 VP2蛋白
VP2蛋白由L2基因编码，是病毒最重要的类型特异性抗原，可与VP5一起与病毒中和抗体反应。AHSV9的9个血清型L2基因的cDNA具有典型环状病毒的5′-GTT和TAC-3′末端序列。L2基因ORF编码的蛋白质分子量约为123ku。AHSV 9个血清型的VP2蛋白序列变异范围为47.6% ~ 765438±0.4%，是AHSV变异率最大的蛋白[4]。
BentleyL等[5]通过噬菌体展示技术和各种抗血清鉴定了重组AHSV-3VP2蛋白的多个抗原区域。大多数抗原位点和中和位点位于252 ~ 488个氨基酸之间。该区域不仅病毒血清型之间不同，而且多为亲水性氨基酸，其中369aa~403aa之间存在线性表位[6]。此外，这些抗原位点的内部序列在存在交叉反应的病毒血清型之间高度一致，因此存在交叉反应的病毒血清型之间具有更高的同源性。这可以解释血清型之间的血清学交叉反应。
AHSV-4VP2蛋白的主要抗原区域为199aa ~ 414aa，而1aa ~ 199aa (N端)和414aa ~ 1060aa (C端)无免疫原性[7]。AHSV-4VP2有15个抗原位点，分为两组。一组覆盖223个AA ~ 400个AA，包括12个抗原位点；另一组包括568aa ~ 681aa，包括其他三个抗原位点。VP5与VP2的相互作用可以更好地展示VP2的中和表位，从而增强免疫应答。
15位点中有3个位点能诱导产生抗AHSV-4的中和抗体，其中2个中和表位分别位于321aa ~ 339aa和3。
77aa~400aa[7].这两种抗原表位的结合可以诱导更有效的中和反应，但中和抗体的效价相对较低，因此不太可能用于生产AHSV的合成疫苗。这种效应可能是由于抗体与一个表位结合引起的构象变化，使得其他抗体更容易与另一个表位结合。另一个原因可能是这两个位点的中和反应在病毒感染中的作用不同(如病毒对细胞的吸附、病毒易位等。)或者它们构成相对不连续的表位的连续部分。ASHV-9VP2还具有两个中和表位[5]。同时，BTV在同一区域也有中和表位，特别是328-335 AA之间和327-402 AA之间。因此，该区域可能是环状病毒的主要抗原表位和重要中和抗体靶点。这些表位可以在病毒衣壳的表面，因为中和表位通常结合到病毒表面，以防止病毒结合到细胞的受体并被细胞吸收。特别是，这两个中和表位位于蛋白质最疏水的区域，该区域极有可能存在于病毒表面。用ELISA检测[7]中的15抗原位点，发现抗原位点8，11和12能与抗体结合，抗原位点4，6和15能与抗体反应，但不显示中和活性，特别是位点4，它在病毒表面，但不被诱导。其他位点不与抗体反应，表明它们可能嵌在病毒中。
非洲马瘟病毒的内部排列
虽然暴露于病毒表面，但该表面以不被抗体识别的构象形式存在。
2.2 VP5蛋白
VP5蛋白由M6基因编码。M6基因5’-末端非编码区的保守序列为5’-gu uaa-3’，在BTV和与AHSV相关的流行性出血热病毒(EHDV)中也有反映。3’-末端非编码区的保守序列为5’-ACA UAC-3’，唯一的例外是AHSV-6，其3’-末端有一个胞嘧啶核苷酸，为5’-ACA uacc-3’。M6基因ORF编码的蛋白质分子量约为56.9ku
AHSV-6、AHSV-4、BTV-10和EHDV-1的VP5氨基酸序列具有高度的一致性[8]。三个保守区域分别位于N端(1aa ~ 123aa)、中间(192aa ~ 273aa)和C端(438aa ~ 491aa)。这些保守区域可能与VP2或VP7相互作用，从而维持病毒结构的稳定性。作为外壳蛋白，ASHV血清型之间的VP5蛋白具有高度相似性，而VP5被VP2蛋白包围，因此不能与宿主中和。
VP5蛋白根据疏水性分布图[8]分为两部分，N端区(1aa~220aa ~ 220aa)和C端区(约280aa~505aa)，中间是一个丙氨酸-甘氨酸富集区(200aa~270aa)作为铰链连接这两部分。n端是螺旋状，C端是球状。这些区域在稳定蛋白质内部和之间的分子结构中发挥作用。VP5的重要功能是与更保守的核心蛋白相互作用，补偿VP2蛋白的变化。VP5可以间接影响病毒的血清型，它与VP2相互作用改变VP2的构象，从而引起病毒血清学特征的变化。
VP5单独或与VP2***一起表达可诱导AHSV特异性中和抗体的产生[9]。在N端的330个残基中，VP5蛋白最明显的免疫优势区有151aa ~ 200aa和83aa ~ 120aa两个抗原区域，分为八个抗原位点，中和表位分别为85aa~92aa和179aa ~ 10。前者中和表位在不同的环状病毒中高度保守，其单克隆抗体能识别BTV和EHDV的VP5蛋白。
2.3 VP7蛋白和VP3蛋白
VP7蛋白和VP3蛋白分别由S7和L3基因编码，它们是该病毒的主要内衣外壳蛋白。VP7在ASHV的所有血清中高度保守，这就是其原因。
非洲马瘟抗原的结构
病毒血清群特异性抗原[10]。MareeS等人[11]用重组杆状病毒在昆虫细胞中克隆和表达了ASHV-9的VP3和VP7。VP7的表达水平较高，并聚集成独特的晶体，VP3和VP7***的表达可在细胞内形成核心样颗粒。AHSVVP7蛋白在感染细胞的细胞质中形成一个平面六方晶体，而重组杆状病毒表达的VP7形成一个大的盘状晶体，在光学显微镜下可以看到。
电子显微镜下，AHSV的VP3和VP7蛋白形成的核心样颗粒与ASHV的空核心颗粒非常相似。与ASHV核心不同，核心状粒子有一个黑暗的中心区域，呈现典型的二十面体对称结构。外层被低电子密度层包围，呈结节状，向外延伸形成具有绒毛外观的核状颗粒。AHSV核心颗粒的直径约为72nm，与冷冻时电镜下BTV核心颗粒的直径一致，但略大于ASHV核心颗粒。用VP7单克隆抗体与AHSV核心颗粒反应对其进行修饰，在电镜下可以看到每个颗粒周围都有一个阴影，这个阴影是VP7单克隆抗体与VP7外壳相互作用形成的。
Wade-Evans等人研究了AHSV-9VP7作为亚单位疫苗的应用效果。用纯化的AHSV-9VP7晶体免疫小鼠，并用AHSV-7攻击。发现VP7对小鼠有非常好的保护作用。用细菌原核表达的变性VP7晶体或GST-VP7融合蛋白接种的保护作用弱于用VP7晶体接种，说明VP7蛋白的构象在蛋白的功能中起重要作用。用AHSV-9VP7免疫的Balb/c小鼠产生的被动抗体不能保护新生小鼠免受AHSV-7的感染，这表明抗体可能不是唯一的保护因素。该病毒有三个非结构蛋白，即NS1、NS2和NS3/NS3A。它们分别由M5、S8和S10基因编码。
3.1 NS1蛋白
NS1在AHSV是高度保守的。Huismans和Els在1979中发现，被环状病毒感染的细胞的细胞质中存在独特的病毒特异性微管。
非洲马瘟病毒的重组过程
结构，它由NS1组成。BTV感染细胞内有大量微管，主要分布在细胞核附近或周围。这些形态结构附着在细胞骨架的中间丝上。它们的作用可能是将成熟的病毒颗粒从病毒包涵体转运到细胞膜，然后通过NS3的作用释放病毒，或者作为分子伴侣阻止核心颗粒在次要蛋白(VP1，VP4和VP6)与病毒基因组正确结合前组装。
用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的BTV和EHDV NS1均形成微管。BTV的NS1的微管直径为52.3nm，由NS1的二聚体形成的螺旋组成，每个螺旋有22个NS1的二聚体。Maree和Huismans用杆状病毒在昆虫细胞中表达AHSV-6NS1，并通过蔗糖梯度密度离心沉降分析NS1微管。200s-400s收集到大量目的片段，说明表达的NS1蛋白以颗粒或多聚体的形式存在于感染细胞中。虽然NS1是这些片段的主要蛋白质成分，但也有一些其他编号不同的蛋白质，推测为杆状病毒蛋白质。
在NS1的200 s ~ 400 s复合物中，微管的平均直径为23nm±2nm，最长可达4 μ m，长度不等可能是由于纯化过程中的断裂，这也可能是NS1在蔗糖梯度中沉降系数不同的原因。在电子显微镜下，AHSV微管的精细结构在外观上与BTV和EHDV微管有很大不同。AHSV微管有一个内部结构，它的形式是精细的网络交叉波纹。每个微管的中心区域具有交替的电子密度，而低密度区域代表微管的空腔。微管边缘光滑，边界清晰，没有可见的亚单位结构。在较宽的BTV微管(68nm)和EHDV微管(52nn)中没有阶梯或分段的外观。空心环结构可以代表微管的横截面或大微管的非常短的片段。这些结构的直径与ASHV微管一致，空腔直径约为7nm。
在200 s ~ 400 s片段中也有少量杆状病毒的特异性微管。这些微管明显不同于AHSV微管。它们更大(直径40纳米)，具有不同的精细结构。AHSV微管可以通过抗体识别。将微管固定在网格上，并与ASHV-6抗血清结合。由于抗体与NS1结合，电镜下NS1微管周围有阴影，但没有杆状病毒的微管。
NS1微管在0.2mol/L和更高浓度的CaCl2 _ 2中不稳定，只能看到无定形的蛋白质聚集体。在1mol/L NaCl中，仅可见少数微管，其长度明显缩短，并有许多环状形式。在缓冲溶液中或pH 8.0-8.5之间，微管的形态也受到严重影响，长度减少，精细结构消失。NS1微管可以耐受相对较低的pH，但在碱性条件下比BTV微管更容易降解。在pH 5.0-5.5之间，微管的长度减少，表面变得不平整。在pH5.0或更低时，微管变性，NS1聚集成无定形蛋白质聚集体。
3.2 NS3/NS3A蛋白
与NS1和NS2的高表达水平相比，两种最小的非结构蛋白NS3和NS3A在感染细胞中少量合成。这两个相关的蛋清由S10基因上两个相同的重叠开放阅读框编码。两者唯一的区别是NS3的N端比NS3A多10个氨基酸。NS3存在于感染细胞的细胞膜上，尤其是Vero细胞细胞膜上AHSV的释放位点，表明NS3与病毒的形态发生和释放有关。病毒释放可能发生在细胞病变效应或细胞溶解之前。重组杆状病毒表达的AHSVNS3是一种膜相关蛋白，其定位不依赖于AHSV颗粒的存在。另外，重组杆状病毒表达ASHVNS3时，只合成了24ku的NS3蛋白，没有合成NS3A。
AHSVNS3的变异率在AHSV蛋白中仅次于外壳蛋白VP2[12]。ASHV-8的NS3基因型变异率为27.6%，而ASHV-4的变异率仅为15%。类型之间的变异率可用于区分同型病毒的亚型。NS3序列的差异可用于区分同一血清型的野毒株和减毒活疫苗株，2.3% ~ 9.7%的变异率足以区分，尤其是结合系统发育分析时。
ASHVNS3的系统发育研究将NS3蛋白分为三个不同的系统发育谱系，命名为α、β和γ[13]。AHSV-4，5，6，8和9的NS3属α，ASHV-3，7和8的NS3属β，以及ASHV-2的NS3属γ。尽管三个NS3进化组之间存在明显差异，但特定的AHSVNS3属于哪个进化组不仅仅取决于病毒血清型。AHSV的基因重排可以解释一些大的变异率。基因重排自然发生在具有分段基因组的病毒中，例如正粘病毒和呼肠孤病毒。多种血清型的斑马和马混合感染可能导致不同血清型之间S10片段的重组。NS3表型群的血清型分组表明，在同一NS3进化群中的那些血清型更可能交换S10基因。
AHSV-3到9的NS3长度为217aa，而ASHV-2的NS3蛋白长度为218aa。NS3的保守区包括NS3A的甲硫氨酸起始密码子、一个富含脯氨酸的区域(22aa~34aa)、一个高度保守的区域(43aa~92aa)和两个可以形成跨膜螺旋的疏水结构域(116aa ~ 137aa和154aa ~ 65438+)。这些结构特征在包括BTV在内的其他环状病毒的NS3蛋白中是常见的。BTVNS3的两个疏水区横跨细胞膜[15]。BTVNS3也有糖基化位点，可以阻止BTVNS3的降解[15]。AHSVNS3与BTVNS3有很大不同，除了一些保守的特征。没有证据表明AHSVNS3的糖基化起重要作用，因为一些病毒血清型的NS3没有推定的糖基化序列。BTVNS3在杆状病毒表达系统中高水平表达，AHSVNS3低水平表达，只能通过western blot或放射性标记检测。
AHSVNS3的大部分不同氨基酸存在于三个区域，即N端43个氨基酸，C端93aa ~ 153aa和15个氨基酸。变异最大的区域(变异率为82.4%)在136aa和153aa之间。除AHSV-2外，所有血清型的ASHV在123aa位置有一个保守的半胱氨酸，ASHV-2NS3的半胱氨酸在120aa位置，而第二个半胱氨酸(164aa)在所有血清型中都是保守的。此外，在细胞膜上该蛋白的锚定区还有一个高度保守的N-十四基序(60aa~65aa或59aa~64aa)。在十四烷基基序的末端是带正电荷的氨基酸区域。这两个特征都在上面提到的43aa~92aa的高度保守区域。与其他环状病毒的NS3蛋白相比，所有这些蛋白的氨基末端区域中的N-十四烷基基序是高度保守的。单独的十四烷基烷基化不能为蛋白质附着在磷脂双层膜上提供足够的能量。其他病毒的膜相关/结合蛋白，如人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的Gag蛋白和劳德氏肉瘤病毒的Src蛋白，含有一个碱性氨基酸区，可以稳定膜相互作用。在所有环状病毒的NS3蛋白中都有一个相似的二元基序，可能是NS3蛋白的膜靶向信号。
ASHVNS3的两个疏水区与细胞毒性相关。任何疏水区域的变化都不会改变蛋白质对膜的靶向性，但可以释放它们在膜上的锚定，从而防止它们在细胞表面的定位并消除它们的细胞毒性作用。杆状病毒表达的AHSVNS3对昆虫细胞(Sf9细胞)的细胞毒作用是通过改变细胞膜的通透性实现的。