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临床微生物检验快速诊断技术的研究进展
关键词:分子生物学来源:CHKD期刊全文数据库《当代医学》，2009年第16期
(作者单位:解放军第252医院李素丽)
目前，传染病仍然是人类健康的一大隐患。随着新的、突发性传染病的出现，已经得到控制的传染病卷土重来，引起传染病的微生物种类也越来越复杂。常见病原微生物的威胁并未消除，但出现了大量耐药菌株，新的病原微生物的出现给临床诊疗带来了很大的麻烦。严峻的现实对病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。世界卫生组织(世卫组织)向临床微生物实验室提出，临床微生物实验室应尽可能专注于快速诊断。利用一切手段将实验室数据转化为临床有用的信息。
1自动识别技术的应用
临床微生物的实验室检查主要以染色、培养和生化鉴定为主，尤其是分离培养，至今仍是许多病原体检测的“金标准”。但细菌生长繁殖需要一定的时间，因此很难缩短检测周期。此外，许多病原体的培养受到营养需求、抗生素应用和病原体含量等因素的影响。传统的手工方法操作复杂，检测周期长，灵敏度和特异性有限。为了解决这个问题，各种自动培养和鉴定系统不断产生。随着计算机的发展和应用，出现了许多自动和半自动的细菌鉴定和药敏系统，统称为“微生物鉴定专家系统”。这些系统大大提高了临床实验室的工作效率和检测准确率，传统的鉴定方法也逐渐得到改进，在一定程度上加快了检测速度。
2免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应来检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。各大文献数据库提供的数据显示，几乎所有的病原体血清学检测方法都已建立，说明该方法已成为微生物实验室常用的成熟检测技术。
2.1凝集技术常用的凝集技术有胶乳凝集技术和血清凝集技术。用于微生物的初步诊断、分型和鉴定，如霍乱弧菌和志贺氏菌、大肠杆菌O.57: H7、脑膜炎球菌等的分型。，并且可以在短时间内完成识别。该诊断方法简便、快速、准确、特异，阳性率高。
2.2荧光抗体技术荧光抗体技术是基于抗原抗体反应的高度特异性，以荧光素为抗原标记物，在荧光显微镜下对特异性抗原抗体复合物及其存在部位进行检查。荧光抗体技术的主要特点是特异性强、速度快。吕支林等报道，美国同事制造的炭疽杆菌细胞壁特异性荧光(CW-DFA)和荚膜抗原(CAP-DFA)标记的单克隆抗体能快速鉴定炭疽杆菌。
2.3酶免疫分析酶联免疫分析(ELISA)已被广泛用于多种病原微生物的检测，可检测样本中的病原抗原和体内的抗体成分。采用硝酸纤维素膜上的单克隆抗体结合斑点酶联免疫吸附试验，成功地从患者咽拭子标本中检测出可能的肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。Gehring等人通过酶联免疫化学发光法(ELIMCL)确定了大肠杆菌O.57: H7。许多疾病已经通过商业试剂盒检测出来。
3分子生物学技术
随着分子生物学技术的快速发展，人们对微生物的认识逐渐从外部表型转向内部基因结构特征，微生物检测也从生化和免疫方法转向基因水平检测。对于那些难以培养和不可能培养的微生物，可以直接获得遗传信息，这给微生物检测带来了新的领域，为科学的快速发展提供了新的机遇。
3.1 PCR技术灵敏度高，特异性强。在病原体检测中，常规方法往往难以准确检测出形态和生化反应不典型的微生物，即使出现大量死菌PCR也能做出准确鉴定；没有混合标本的影响，可以很容易地从含有大量正常菌群的标本中鉴别出病原体；用于鉴定生长缓慢或难以培养的微生物，如分枝杆菌、幽门螺杆菌、支原体、衣原体、水绵等。，目前其他方法的阳性检出率很低，PCR技术对此类菌株的鉴定具有重要意义。
但常规PCR技术存在假阳性、引物二聚体形成、检测操作复杂、中间污染环节多等问题，容易出现假阳性或假阴性结果。为了克服这些缺点，一些新的PCR技术逐渐衍生并应用于实践，如巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR(UP-PCR)、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA多态性扩增(RAPD)、限制性长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR等。
3.2基于16S rRNA和GyaB的检测技术
3.2.1检测以16S rRNA为靶基因16S rRNA存在于所有原核细胞中。它们相对稳定且具有高拷贝数，并且它们的序列包含可变区和高度保守区，因此可以设计群、属和种特异性探针。目前各种常见细菌的16S rRNA基因几乎全部测序完毕。16SrRNA编码基因的这些特性使其成为细菌基因分类的理想靶序列，并逐渐成为细菌鉴定和分类的“金标准”。
3.2.2利用促旋酶B亚基基因靶基因检测GyaB不仅具有16S rRNA的优点，而且基因进化率比核糖体基因高，几乎在所有细菌中都是以单拷贝形式存在。研究表明，基于GyaB序列的进化图谱与基于DNA-DNA杂交的进化图谱是一致的。因此，GyaB的分析特别适用于菌株的区分和鉴定。Fukushima等人设计了以GyaB基因为靶基因的基因芯片来检测分枝杆菌。实验结果表明，该芯片能在种水平上鉴定分枝杆菌，并能区分亲缘关系较近的菌株，对临床治疗具有重要的参考价值，表明分析GyaB基因序列是一种快速有效的种水平鉴定细菌的方法。
3.3多位点序列分型多位点序列分型(MLST)是近年来发展迅速的一种分子生物学分析方法。它具有高分辨率，适用于分子流行病学和分子进化。国际上越来越多地将MLST作为比较菌株的常用工具，建立更精确的分析系统方法，研究不同抗生素耐药菌株、相关特殊基因型和新变异引起的疾病和人群结构的流行病学分析。
3.4环介导等温扩增(LAMP)环介导等温扩增(LAMP)是近年来发展起来的一种灵敏、特异、方便、快速的核酸扩增技术。与传统方法相比，等温扩增不需要热循环，且由于反应中产生大量白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物无需电泳，通过肉眼观察或浊度仪即可判断。因此，LAMP是一种特异性强、灵敏度高的DNA扩增方法，无需热循环仪，肉眼即可判断结果。该方法针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，用链置换聚合酶在恒温(65℃左右)60min左右完成核酸扩增反应，扩增出特征性的梯形条带。设计两个环状引物，反应速度可提高1/2 ~ 1/3。LAMP技术可用于病原微生物的野外快速检测，战时可在野外和基层推广应用。
4分子生物传感器
分子生物传感器是新兴传感器技术与分子诊断技术相结合的新技术，是现代临床诊断发展的新方向。由于生物传感器具有检测准确、操作简单的特点，近年来在许多领域取得了很大的进展，并在未来的传染病诊断、药物筛选、生物战剂监测等方面得到了广泛的应用，其中DNA生物传感器是临床上最常用的病原体检测传感器。中国科学家陈建柱最新制成的生物传感器，只需20秒就能检测出微量SARS病毒、天花病毒、炭疽的存在，从而达到早期诊断的目的。
5基因芯片
基因芯片是一种高通质量指数分析系统。基因芯片技术是一项全新的技术。由于具有一次检查上万个基因的优势，被视为基因功能研究中最伟大的发明。它以许多特定的寡核苷酸片段或基因片段为探针，有规律地排列固定在硅片、玻璃片、尼龙膜等固体介质上，形成一个生物分子点阵，从而达到在一次测试中同时检测多种疾病或样本的目的。基因芯片基于高通量、微型化和平行分析的特点，在微生物病原检测、物种鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测和基因组监测等研究领域发挥着越来越重要的作用。目前已经完成了细菌、病毒等多种病原体的基因组测序。许多代表各种微生物的特殊基因被制成1芯片，通过逆转录可以检测样本中病原体基因的表达和表达水平，从而判断患者的病原体、感染过程和宿主反应，大大提高了检测效率。
6蛋白质指纹技术
蛋白质指纹技术是随着蛋白质组学的兴起而出现的一项新技术。近年来，越来越多的学者意识到从蛋白质水平研究微生物的必要性。蛋白质是细菌功能的执行者。细菌种类繁多，不同的蛋白质类型决定了细菌千变万化的功能和特性。在1996中，Clayin等人通过MALDITOF MS质谱成功鉴定了革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，表明不同属种的细菌具有不同的蛋白质指纹，同一细菌具有相似的蛋白质指纹。根据细菌的蛋白质指纹图谱，可以快速鉴定细菌。中国科学院微生物研究所唐红研究员等。可以利用最新的“蛋白质质量指纹”技术及其检测方法，分析SARS和非SARS患者血清中蛋白质组成的变化。这种检测SARS病毒的方法已经被北京天坛医院临床证实。阳性率接近95%，特异性接近96%。在患者发热的第一天即可获得满意的检测结果。有专家表示，蛋白质指纹技术标志着划时代诊断模式的诞生。
随着计算机技术的不断发展，临床病原体的检测将向两个方向发展:高度自动化和简单快速的检测技术。通过自动化仪器的使用，分子生物学技术将在病原菌的诊断和鉴定以及耐药基因的检测方面发挥巨大作用。随着多学科时代的到来，将彻底改变临床病原体检测的现状和传统观念，实现高效率、高质量、快速统一。