补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能和细胞形态学影响的探讨
脑缺血属于中风范畴，是临床常见病，具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点，严重危害人类健康。迄今为止，国内外仍缺乏治疗脑缺血及其后遗症的有效化疗药物。循证医学表明，中医药治疗缺血性中风具有一定优势。目前，大量研究集中在中药对急性脑缺血损伤的保护作用。但是脑缺血后的功能恢复是一个漫长的过程，长期以来对其研究很少。补阳还五汤是治疗缺血性中风及中风后遗症的经典方剂，出自清代王清任的《医林盖草》。该方临床应用广泛，疗效确切，但其促进神经功能恢复的机制有待进一步阐明。本文采用大脑中动脉闭塞法复制大鼠局灶性脑缺血模型，探讨补阳还五汤对其神经功能的长期保护作用，以期为缺血性中风的临床用药提供实验依据。
1材料
1.1动物健康雄性SD大鼠，189，SPF级，体重260 ~ 280 g，购自湖南省斯莱克京达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(湘)2009-0004，动物合格证号004535。
1的处方。2补阳还五汤出自王清任《林逸盖厝》，由黄芪120 g，赤芍4。5 g，川芎3 g，归尾6 g，干地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g，药材均符合中国药典2005年版。补阳还五汤制备:将饮片用清水浸泡30 min，第一次煎煮时加入药材和5倍量的双蒸水，煎煮60 min，第二次煎煮时加入5倍量的双蒸水，煎煮60min，将两次煎煮液混合均匀，浓缩至含生药2g·mL-1，冷藏备用。
1.3试剂10%水合氯醛(扬州奥鑫助剂厂)、多聚甲醛(长沙锦华化工有限公司)、TTC(适马红四唑公司)。
1.4仪器Bx51光学显微镜和IPP5。1图像分析系统(日本奥林巴斯)、FA电子天平(上海泰之恒电子衡器有限公司)、全自动双纯水蒸馏器(上海玻璃仪器一厂)、Finesse 325切片机(英国山道)。
2种方法
2.1分组及给药大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组，每组63只。每组动物分为三个时间点，即首次给药后7，14，21天，每个时间点21只动物。补阳还五汤组动物术后2小时开始服药，剂量为5g·kg-1d-1，ig 1次，每日1次。模型组和假手术组给予等体积蒸馏水。
2.2模型制备与评价参考文献:大脑中动脉闭塞复制局灶性脑缺血大鼠模型:10%水合氯醛(3±3。5 mL kg-1) ip麻醉。颈部正中切口约3cm长，逐层分离，结扎颈外动脉，夹闭颈内动脉，然后结扎颈总动脉，约在颈总动脉分叉下方。假手术组仅切开皮肤，分离左侧颈总动脉后缝合。手术后，将动物放入垫有干净填充物的饲养箱中，它们可以自由饮水和进食。清醒2小时后，根据Longa和Bederson的五分法对动物进行评分，得分为1 ~ 3者入组。0:无神经损伤症状；1分:对侧前爪不能完全伸出；2分:转向对面；3分:向对面倾倒；4分:无法自主行走，意识丧失。分数越高，神经功能缺损越严重，反之亦然。排除标准:分数低于1；蛛网膜下腔出血；HE染色显示无脑缺血病理改变；在时间之前死去。死亡等动物不足时随机替换。
2.3指标检测
2.3.用1 TTC染色法测量每组5只大鼠在各时间点的脑梗死面积比。10%水合氯醛麻醉后，断头取脑，于-20℃冷冻20 min，距额极每2 mm切1片。1刀在大脑前极与视交叉连线的中点；第二刀在视交叉；第三把刀在漏斗柄处；第四刀在漏斗柄和后叶尾极之间，用***A、B、C、D、e 5片，用2%红色四氮唑染色，37℃避光30 min，正常组织为暗红色，梗塞组织为白色。拍照后选择最大缺血切片C的梗死面积，用Image-Pro Express图像分析系统扫描计算，表示梗死面积占C切片总脑面积的百分比。为了消除梗塞半球脑水肿造成的误差，用Swanson法校正后计算C切片上梗塞面积的百分比。is =(s 1-Sr)/2s 1×100% s 1:C片健侧总面积；Sr:C片患侧非梗死区面积。
2.3.②神经功能评分:各时间点每组大鼠10，术后2小时和动物处死前1小时进行神经功能评分。
2 . 3 . 3 HE染色观察海马和皮质的组织病理学变化，每个时间点每组6只。用和2一样的方法。3.1，4%多聚甲醛取脑背面固定24 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，脑连续切片(厚度5微米)，含海马的切片贴在载玻片上，he染色，光镜下观察并比较各组左侧海马和皮质组织细胞的形态病理变化。
2.4统计分析
所有数据均以x±s表示，数据用SPSS 19进行统计分析。0.组间比较采用单因素方差分析，P
3个结果
3.TTC染色比较1组的脑梗死面积，假手术组均匀染成深红色。7，14，21 D模型组和补阳还五汤组染色不均匀，局部梗死区呈白色，梗死区在缺血的顶叶皮质和海马周围。梗死面积分析显示，模型组和补阳还五汤组梗死面积随时间推移逐渐减小(P
3.2各组神经功能评分在各时间点假手术组均为0分；补阳还五汤组神经功能评分低于模型组，差异有统计学意义(P < 0)。05) 。
3.3各组海马和皮质的形态学变化
3.3.1海马假手术组形态正常，细胞轮廓清晰，核染色均匀，细胞排列有序，间质染色均匀。7，14和21 d模型组海马神经元皱缩，细胞核固缩，核边缘严重，细胞内出现空泡，细胞形态由椭圆形变为梭形和三角形，细胞间距增大，间质染色稀疏，有孔洞。7、14、21 d补阳还五汤组与模型组相比，海马内空泡样细胞数量明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列较模型组更为有序。7，14 d补阳还五汤组仍有少数细胞核染色深，呈空泡样改变，但补阳还五汤组海马细胞形态接近假手术组。
3.3.2皮质假手术组皮质细胞形态正常，边缘清晰，排列整齐，形态完整，细胞核及细胞间质染色均匀。7、14、21 d模型组缺血细胞出现空泡样坏死，细胞形态丧失，细胞间隙增大，染色变浅，呈网状改变；残存细胞体积缩小，细胞核浓缩染色深，细胞界限不清。与同时期模型组相比，补阳还五汤组皮质细胞内空泡样细胞数量明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列整齐，细胞核更清晰，细胞间隙染色更均匀。
4讨论
局灶性脑缺血又称缺血性卒中，是脑血管疾病最常见的临床类型，是由于脑的血液供应发生障碍，导致脑组织缺血缺氧，导致相应区域的脑梗死坏死，大量神经元丧失，产生相应的神经功能缺损症状和体征。目前西医治疗脑缺血的方法主要有溶栓、抗凝、降纤、扩血管、高压氧、介入治疗、基因治疗、神经干细胞移植等，尚处于动物实验阶段。在这些治疗方法中，除了超早期(发病3小时内)溶栓治疗有效率高达21% ~ 93%，其他治疗方法效果不确定。而且，由于其严格的时间窗，溶栓治疗意味着只有不到5%的患者有机会做这种治疗。因此，约80%的缺血性脑卒中患者会留下不同程度的后遗症——神经功能缺损。
典型的缺血性中风根据病程可分为三个阶段。急性期1，中风后1个月内；第二恢复期，中风后2 ~ 6个月内；3期后遗症，中风后6个月。补阳还五汤主要用于脑缺血恢复期及后遗症期的治疗，是治疗脑缺血后遗症的首选药物，临床应用疗效显著。所以在动物实验中，最长的观察时间是缺血后21 d，相当于人脑缺血的后遗症。本实验研究中，神经功能评分结果显示补阳还五汤能促进脑缺血后大鼠神经功能的恢复。其作用机制被学者认为是促进血管生成，扩张血管，抗凝溶栓改善脑缺血局部微循环，减轻脑水肿和氧自由基损伤，保护脑组织，从而促进神经功能的恢复。本实验室及国内其他实验室的研究表明，补阳还五汤能促进缺血后脑内神经干细胞的增殖、迁移和分化，这可能是其促进缺血后神经功能恢复的机制之一。通过比较各组动物的脑梗死面积的比值，结果显示补阳还五汤组的脑梗死面积明显小于同时期模型组。可能的原因有:一、补阳还五汤在急性脑缺血时对大脑起保护作用，抑制大量神经元死亡和凋亡，使梗死面积变小；其次，补阳还五汤促进缺血后脑组织的再生、修复和代偿，导致梗死面积比相应模型组小；也有可能两者兼得。此外，通过比较补阳还五汤组与模型组缺血后海马和皮质的组织学变化，结果表明补阳还五汤能明显改善脑缺血损伤后细胞形态和排列，促进组织修复。
总之，本研究证实了补阳还五汤具有降低脑缺血神经功能评分、减少脑梗死面积、改善脑组织细胞形态和排列的脑保护作用，为该药临床治疗缺血性中风提供了有力的实验依据。
；