细胞工程论文

细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，在细胞水平上进行遗传操作，根据人们的设计蓝图进行大规模的细胞和组织培养。下面是我给大家的细胞工程论文。欢迎阅读。

目的制备脱细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法化学提取结合TNT和十二烷基磺酸钠制备脱细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞接种到支架上7天后，免疫组化检测细胞增殖活性、NT3和BDNF的表达，扫描电镜观察细胞超微结构。结果支架内细胞被完全去除，主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完整。羊膜上皮细胞在支架中具有增殖活性，并且对NT3和BDNF呈阳性。扫描电镜显示羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论脱细胞肌肉组织工程支架制备成功，与人羊膜上皮细胞具有良好的相容性。

脱细胞肌肉；人羊膜上皮细胞；生物相容性

近年来，组织工程研究的重要进展之一是利用自体或异体移植物制作天然可生物降解材料的组织工程支架。其中，脱细胞移植物与机体具有良好的生物相容性。脱细胞肌肉支架可作为支持神经细胞轴突再生的生物工程支架。Mligiliche等[1]将脱细胞肌肉移植到大鼠坐骨神经缺损处，4周后发现大量神经轴突长入脱细胞肌肉支架。由于单纯脱细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，脱细胞肌肉支架往往需要植入种子细胞到支架中才能发挥更大的作用[2，3]。研究表明，羊膜上皮细胞可以分泌多种神经因子[4，5]，促进神经元轴突的生长，是治疗神经系统疾病的良好种子细胞。本研究采用化学脱细胞法制作脱细胞肌肉支架，将羊膜上皮细胞接种于脱细胞肌肉支架中，探索其相容性，为组织工程治疗神经系统疾病提供了新的途径。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

1.1.2试剂IMDM培养基及小牛血清由Hyclone公司提供。5’溴尿苷(BrdU)和抗BrdU的单克隆抗体购自Neomarker公司。神经营养因子(NT)3和脑源性神经营养因子(BDNF)的兔抗人多克隆抗体购自武汉博士公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈信生物公司。本实验室保存了人羊膜上皮细胞系。

1.2方法

脱细胞肌肉支架的制备1.2.1根据Brown等[6]脱细胞膀胱的制备方法制备脱细胞肌肉支架，简单描述如下:取Wistar大鼠的腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇匀48 h，然后转入3% TritonX100溶液中。然后放入蒸馏水中，在37℃、50 r/min下振荡48 h。换成1% SDS溶液，37℃，50 r/min，摇匀48 h。PBS洗涤24小时。保存在4℃的PBS中备用。

1.2.2支架的形态结构观察和成分鉴定肉眼观察脱细胞肌肉的形态。脱细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖固定90 min，15%蔗糖固定90 min，30%蔗糖梯度脱水过夜，OCT包埋，冷丙酮快速冷冻，然后-70℃冰箱保存。冰冻切片和he染色观察内部结构。此外，使用Van Gienson(VG)染色和Weigert染色(VG+ET染色)来检测支架的细胞外基质成分。

1.2.3人羊膜上皮细胞在DMEM培养基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml谷氨酰胺)中培养，37℃，5%。

1.2.4鉴定人羊膜上皮细胞和无细胞肌肉支架之间的相容性

1.2.4.1取生长良好，80%接近融合的人羊膜上皮细胞，弃去培养基，用0.25%胰蛋白酶消化。当细胞体回缩，细胞间隙变宽时，停止用血清消化，在瓶壁上反复轻吹细胞，在离心管中制成单细胞悬液，65438±0000 r/min用DMEM重悬细胞。用1 ml的注射器吸入细胞悬液，以2×106个/ml的密度注入脱细胞肌肉支架，分装于24孔板中，于37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，隔天换液培养1 W..加入Brdu(终浓度:10 mg/L)，连续培养1 d后，在恒温箱中用切片机切片(方法同前)。切片经PBS洗涤后，3% H2O2灭活内源过氧化物酶65438±00min，血清封闭20 min。一抗与BrdU单克隆抗体(稀释1 ∶ 1 000)、BDNF和NT3多克隆抗体(稀释1 ∶ 1 000)在4℃孵育过夜，然后与PBS在37℃孵育30 min，再与SABC37℃孵育30 min。在光学显微镜下观察。

1.2.4.2扫描电镜鉴定羊膜上皮细胞在脱细胞肌肉支架上的生长情况。当80%的人羊膜上皮细胞接近融合时，按上述方法消化，种植于脱细胞肌肉支架中，置于24孔板中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养7 d，然后孵育2天。

2结出果实

2.1支架的组织结构和成分脱细胞肌呈乳白色，半透明，质地柔软。一般来说，去细胞前后肌肉的整体大小和形状没有明显变化。支架纵切面HE染色显示骨骼肌细胞成分消失，而纤维网格结构保持完整，支架主要为平行管。VG+ET染色证明支架主要由胶原纤维、弹性纤维等细胞外基质成分组成，胶原纤维呈红色波浪状结构，弹性纤维呈蓝色丝状结构，如图1所示。

2.2羊膜上皮细胞和脱细胞肌肉支架之间的相容性如图2所示。HE染色显示人羊膜上皮细胞生长良好，均匀分布在支架中(图

图1脱细胞肌肉支架一般用组织切片染色。

图2脱细胞肌肉支架2A的病理照片。免疫组织化学染色显示BrdU阳性细胞数量较多，提示支架中的人羊膜上皮细胞具有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3和BDNF阳性颗粒，它们以棕色分布在细胞质中(图2C和2D)。JSM5600LV扫描电镜显示支架内分布有大量细胞，细胞在支架内分布均匀，生长良好(图2E)。

3讨论

理想的支架材料应该类似于细胞外基质，与活细胞具有良好的生物相容性[7，8]。脱细胞肌作为治疗神经损伤的生物工程支架材料具有以下优势:(1)脱细胞肌的细胞外基质成分在组织细胞的迁移、黏附、生长和代谢中起着重要作用，研究表明再生轴突可以很好地黏附在脱细胞肌支架上[9]。(2)脱细胞肌的排列结构与神经管相似，只是直径略大于神经管[10]，通过[9]为轴突生长提供足够的空间，这对于诱导轴突再生非常重要。Fansa等比较了不同脱细胞生物材料(肌肉、静脉和神经外膜)接种雪旺细胞桥接缺损周围神经的结果，发现缺乏神经管状结构的脱细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突排列紊乱，无规则排列，而具有神经管状结构的脱细胞肌肉支架中的再生轴突排列有序[11]。轴突再生的这种顺序对于神经损伤的轴突再生也是非常重要的。(3)脱细胞肌引起的免疫排斥较小[9，12]。这些优点表明脱细胞肌肉可以作为治疗神经损伤的理想材料。本研究采用的脱细胞肌肉制作方法主要用于减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效去除脂膜、膜相关抗原和可溶性蛋白，有效保留细胞外基质成分的原有空间结构。肌细胞正常情况下是平行分布的，细胞外基质的成分也是平行分布的。从支架的纵剖面看，支架的纤维组分也是平行排列的。VG+ET染色结果显示，细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完整。这些结果进一步证实了该方法可以成功制备脱细胞肌肉支架。

由于单纯脱细胞肌肉支架治疗神经系统疾病效果有限[13]，脱细胞肌肉的生物相容性有待验证。在这项研究中，将人羊膜上皮细胞接种到无细胞肌肉支架中，以探索其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞含有多种生物活性因子，包括粘蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质、IL1、IL8等因子，此外还能分泌BDNF、NT3等重要的神经营养因子[4]。其中，层粘连蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子在神经损伤的治疗中起着非常重要的作用。羊膜上皮细胞可作为理想的种子细胞，与脱细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的理想组织工程材料。在本实验中，观察到人羊膜上皮细胞均匀分布在无细胞肌肉支架中。抗BrdU、BDNF和NT3免疫组化显示，脱细胞肌肉支架中的羊膜上皮细胞具有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，表明羊膜上皮细胞在脱细胞肌肉支架中保持良好的生物活性。上述结果一方面证明了本研究制备的脱细胞肌肉支架具有良好的生物相容性，另一方面为羊膜上皮细胞与脱细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验依据。

总之，本研究成功制备了脱细胞肌肉支架，并证实了人羊膜上皮细胞可以在脱细胞肌肉支架中分泌重要的神经营养因子。人羊膜上皮细胞与脱细胞肌肉支架之间的桥梁为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等多种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于神经缺损更好的修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与脱细胞肌肉支架桥治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。

参考

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3 Gulati AK，Rai DR，Ali AM。培养的雪旺细胞对脱细胞基底膜移植再生的影响。大脑Res，1995；705(12):11824.

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5孟晓涛，陈丹，董，，等。羊膜上皮细胞共培养促进神经干细胞的神经分化和突起生长[J]。细胞生物学实习生，2007；31:6918.

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12 Brown AL，Farhat W，Merguerian PA，等. 22周猪模型中膀胱无细胞基质作为膀胱增大材料的评估[J].生物材料，2002年；23:217990.

13李培建、李炳仓、许。肌基底膜管移植修复脊髓缺损的实验研究[J].中华创伤杂志，2001；17(9):5258.

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