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通过大肠杆菌转化体细胞共表达
羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶基因
表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌转化细胞的合成
纯光学(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
摘要4-氯-3-乙基的不对称还原
氧代丁酸酯(COBE)转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
((S)-CHBE)进行了研究。表达来自木兰假丝酵母的羰基还原酶(S1)基因和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的大肠杆菌细胞被用作
催化剂。在有机-溶剂-水两相系统中，在有机相中形成的(S)-CHBE总计为2.58 M (430 g/l)，摩尔产率为85%。通过连续饲喂在水溶液中不稳定的COBE，共产生S1和GDH的大肠杆菌转化体细胞在含水单相系统中积累了1.25 M (208 g/l) (S) -CHBE。在这种情况下，NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化形式)转化为CHBE的计算值为21 . 600mol/mol。在两个系统中，形成的(S) -CHBE的光学纯度为100%对映体过量。用于涉及大肠杆菌HB101细胞的还原反应的含水系统是简单的，所述大肠杆菌HB 101细胞携带含有S1和GDH基因的质粒作为催化剂。此外，该系统不需要添加市售的GDH或有机溶剂。因此，该系统对于光学纯(S)-CHBE的实际合成是非常有利的。
本文研究了(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯(CHBE)的COBE不对称合成。作为催化剂，大肠杆菌细胞同时表达来自木兰假丝酵母E的羰基还原酶和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。在水/有机溶剂两相体系中，有机相中(S)-CHBE的浓度可达2.58M(430g/l)，摩尔收率可达85%。大肠杆菌S1和GDH的副产物也达到1.25M(208g/l)，COBE在水相中不稳定，因此(S)-CHBE可以在单相中水中连续产生。在这种情况下，从NADP+到CHBE的适当转化达到21，600 mol/mol。在该体系中，形成的CHBE的旋光率为100%对映体过量。使用携带含有S1和GDH基因的质粒的大肠杆菌HB101作为水相不对称还原的催化剂是相对简单的。此外，该系统不需要商业GDH或有机溶剂。因此，该体系非常便于实际合成具有纯光学活性的(S)-CHBE。
光学活性的4-氯-3-羟基丁酸酯是用于药物合成的有用的手性构件。(R)-对映异构体是l-肉碱的前体(Zhou等人，1983)，而(S)-对映异构体是羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂的重要原料(Karanewsky等人
艾尔。1990).许多研究已经描述了4-氯-3-氧代丁酸酯的微生物或酶促不对称还原(Aragozzini和Valenti 1992；Bare等人1991；哈利南等人1995；Patel等人1992；清水等1990；Wong等人1985)基于面包酵母的还原(周等人1983)。我们之前已经表明，木兰假丝酵母AKU4643细胞将4-氯-3-氧代丁酸乙酯(COBE)还原成光学纯度为96%对映体过量(e.e .)的(S)-CHBE(yaso hara等人，1999)。由于该酵母具有至少三种不同的立体选择性还原酶(Wada等人，1998，1999a，b)，由该酵母产生的(S)-CHBE不是光学纯的。从这三种酶中，一种NADPH依赖性羰基还原酶，命名为S1，被纯化并被详细表征(Wada等，1998)。我们克隆并测序了编码S1的基因，并在大肠杆菌细胞中过量表达。该大肠杆菌转化体在葡萄糖、NADP+和作为辅因子发生器(Yasohara)的市售葡萄糖脱氢酶(GDH)的存在下将COBE还原为光学纯的(S)-CHBE
等人，2000年)。
这里，我们描述了共表达木兰梭菌S1和巨大芽孢杆菌GDH基因的三个大肠杆菌转化体的构建，并分析了这些菌株催化的COBE还原。以前关于将COBE酶促还原成光学纯度为92% e.e .的(R)-CHBE的报道(Kataoka等，1999；Shimizu等人(1990)推荐了用于酶或微生物还原的有机溶剂两相系统反应，因为底物(COBE)在水性溶剂中不稳定并使酶失活。我们研究了在水相体系反应中，大肠杆菌转化体将COBE还原为光学纯的(S) -CHBE，并讨论了这种反应体系在工业应用中的可能用途。
光学活性的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是药物制剂合成中重要的手性化合物。其右旋形式是L-肉碱的前体，其左旋形式是羟甲基戊二酰辅酶a还原酶抑制剂的起始原料。许多研究描述了基于面包酵母的微生物或酶对COBE的不对称还原。我们以前已经知道，通过使用来自木兰假丝酵母种AKU4643的细胞，COBE被催化产生具有96%光学纯度的CHBE。这种酵母中至少有三种立体选择性还原酶，并且这种酵母产生的CHBE不是纯光学的。在这三种酶中，NADPH依赖性羰基还原酶，我们克隆并测序了编码S1的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠杆菌转化细胞催化COBE产生纯光学CHBE，以葡萄糖、NADP+和商品葡萄糖脱氢酶作为辅酶因子的启动子。
我们构建了在这三种大肠杆菌转化细胞中表达的巨大芽孢杆菌S1和GDH，并分析了这些菌株催化还原COBE的反应机理。以前的报道表明，酶法还原COBE生产的CHBE光学纯度可达92%。还提到底物(COBE)在水相中不稳定，酶容易钝化，所以反应在有机溶剂/水两相体系中由酶或微生物催化。我们研究了在水单相体系中COBE还原为纯光学CHBE的反应，并讨论了该反应体系在工业应用中的可能应用。
材料和方法
细菌菌株和质粒
本研究中使用的大肠杆菌菌株为JM109和HB101。质粒pGDA2，其中来自巨大芽孢杆菌的GDH基因被插入到pKK223-3中，由大阪大学的I. Urabe教授(Makino等，1989)提供。质粒pSL301和pTrc99A分别购自Invitrogen(美国)和Amersham Pharmacia Biotech(英国)。质粒pUC19和pSTV28 (Homma等人1995；高桥等人(1995)购自修佐Takara公司(日本)。
材料和方法
菌株和质粒
本实验中使用的大肠杆菌是JM 109和HB 101。来自巨大芽孢杆菌的GDH基因被插入到Pkk233-3质粒中，而带有GDH基因片段的pGDA2质粒由大阪大学的浦边教授提供。质粒pSL301和pTrc99A分别由美国Invitrogen公司和英国公司购买。质粒pUC19和pST28由日本的takara公司购买。
本研究中使用的重组质粒构建如下(图1):质粒pGDA2用EcoRI和PstI双酶切以分离包括GDH基因的约0.9千碱基对(kb)的DNA片段。将该片段插入质粒pSL301的EcoRI-PstI位点，构建质粒pSLG。质粒pSLG用EcoRI和XhoI双酶切，以分离包括GDH基因的约0.9 kb的DNA片段。
本实验中使用的重组质粒构建如下:质粒pGDA2用EcoRI和PstI消化以分离含有GDH基因的约0.9kb大小的DNA片段。将该片段插入质粒Psl301的EcoRI-PstI限制性位点以构建质粒pSLG。质粒pSLG用EcoRI和XhoI转化。
为了构建质粒pNTS1G，将该0.9 kb片段插入pNTS1的EcoRI-SalI位点，如前所述(Yasohara等，2000)，构建pntS1以过量生产s 1。为了构建质粒pNTGS1，首先产生质粒pNTG。使用pGDA2作为模板，制备两个合成引物(引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG，和引物2 TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT)用于聚合酶链式反应(PCR)。PCR产生的片段用NdeI和EcoRI双酶切，然后插入到质粒pUCNT的NdeI EcoRI位点，如所报道的(Nanba等，1999)，该质粒由pUC19和pTrc99A构建，以获得pNTG。为了构建质粒pNTGS1，使用含有S1基因作为模板的pUCHE制备两个合成引物(引物3，gccgaattctaagggttaataatgctaagaacttctccaacg，和引物4，GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC)。PCR产生的片段用EcoRI和SalI双酶切，然后插入pNTG的EcoRI- SalI位点，得到pNTGS1。将质粒pNTS1G、pNTGS1或pNTG转化到大肠杆菌HB101中。
构建PNTS1来过表达前述的S1。将该0.9kb片段插入pNTS1的EcoRI-SalI限制性位点，构建pNTS1G。为了构建质粒pNTGS1，首先需要构建pNTG。PCR反应需要两个合成引物(引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG和引物2，TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT)和pGDA2作为模板。用NdeI和EcoRI消化通过PCR获得的片段，并将其插入质粒pUCNT的NdeI EcoRI限制性位点以获得pNTG。据介绍，pUCNT由pUC19和pTrc99A构成。为了构建质粒pNTGS1，两个合成引物(引物3，GCGGATCTAAGTTAAATGGCTAAGATTCCAACG，和引物4，GCGGTCGACTTAGGAAGCGTAGCCCCCCGTC)包括基因S1作为模板。Pcr产物片段用EcoRI和SalI消化，然后插入pntg的EcoRI-SalI消化位点，得到pntg1。将质粒pNTS1G、pNTGS1或pNTG全部导入大肠杆菌HB101。
质粒pGDA2用EcoRI和PstI双酶切以分离包括GDH基因的约0.9 kb的DNA片段。为了构建质粒pSTVG，将该片段插入质粒pSTV28的EcoRI-PstI位点。将质粒pSTVG转化到大肠杆菌HB101中。
质粒pGDA2用EcoRI和PstI消化以获得含有GDH基因的0.9kb DNA片段。为了构建pSTVG质粒，将该片段插入pSTV28质粒的EcoRI-PstI的限制性位点。将pSTVG质粒导入大肠杆菌HB101。
培养基和培养
2×YT培养基由1.6%细菌胰蛋白胨、1.0%酵母组成
提取物和0.5%氯化钠，pH 7.0。大肠杆菌HB 101携带pNTS1，
将pNTG、pNTS1G或pNTGS1接种到试管中，该试管包含
2 ml 2×YT培养基补充0.1 mg/ml氨苄青霉素，
随后在37℃下孵育65±05小时，同时往复摇动。
将该预培养物(0.5毫升)转移到500毫升的摇床中
含100毫升2×YT培养基的烧瓶。细胞被培养
在37°C温度下65438±03小时，往复摇动。大肠杆菌HB101携带
pNTS1和pSTVG同样在2×YT培养基中培养
补充0.1毫克/毫升氨苄青霉素和0.1毫克/毫升氯霉素。
培养基和细菌培养
2*YT培养基含有1.6%细菌用胰蛋白胨，1.0%酵母提取物，0.5% NaCl，pH7.0。
将携带pNTS1、pNTG、pNTS1G或pNTGS1的大肠杆菌HB101接种到2ml含0.1mg/ml氨苄青霉素的2*YT培养基中，并在37℃下振荡15小时。将0.5毫升菌液接种到100毫升2 * YT培养基的500毫升烧瓶中。在37°C的摇床中培养65438±03小时。具有pNTS1和pSTVG质粒的大肠杆菌HB101以类似的方式在2*YT培养基中培养，除了在培养基中加入0.1 mg/ml氨苄青霉素和0.1 mg/ml氯霉素。
无细胞提取物的制备和酶测定
通过离心从100 ml培养液中收获细胞，悬浮在50ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中，然后通过超声破碎。通过离心去除细胞碎片；回收上清液作为无细胞提取物。羰基还原酶S1活性(COBE还原活性)用分光光度法测定如下:测定混合物由100 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)、0.1 mM NADPH和1 mM COBE组成。将反应物在30℃下孵育，并监测340 nm处吸光度的下降。GDH活性的测定混合物由1 M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、100 mM葡萄糖和2 mM NADP+组成。将反应物在25℃下孵育，并监测340 nm处吸光度的增加。一个单位的S1或GDH分别被定义为每分钟催化还原1 μmol NADP+或氧化1 μmol NADPH的量。用蛋白质测量蛋白质浓度
含有考马斯亮蓝(Nacalai Tesque，日本)的分析试剂盒，
使用牛血清白蛋白作为标准(布拉德福德1976)。
无细胞提取物和酶鉴定
100ml培养基离心收获菌体，用50m l 0.1mol/LpH 6.5悬浮，然后超声破碎。细胞碎片可通过离心去除，收集的上清液为无细胞提取物。用分光光度计测定羰基还原酶S1的活性如下:测定的混合物包括0.1mol/LpH6.5磷酸二氢钾缓冲液、0.1mMNADPH和1mMCOBE。反应在30℃下进行，并随时监测其在340nm处的吸光度。用于测定GDH的混合物包括:1m Tris-HCl缓冲液，pH 8.0，100mM葡萄糖和2mM NADP+。反应在25℃下进行，并监测340nm处的吸光度。一个单位的S1或GDH被定义为每分钟1μmol NADP+的催化还原量或1 μmol NADPH的氧化量。蛋白质测定采用含考马斯亮蓝的蛋白质试剂，以牛血清白蛋白为标准。
酶稳定性的研究
将1毫升含有携带pNTS1 (S1: 20 U/ml)的大肠杆菌HB101的无细胞提取物的100 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)与等体积的每种测试有机溶剂在密闭容器中混合。将混合物在30℃振荡48小时后，如上所述测定水相中剩余的酶活性。将含有100 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)、S1 (20 U/ml)和各种浓度CHBE的混合物在30℃下孵育24小时，以研究在CHBE存在下酶的稳定性。如上所述测定剩余的酶活性。
酶的稳定性研究
将1毫升含有含pNTS1质粒的大肠杆菌HB101的无细胞提取物的100mM磷酸二钾缓冲液(pH6.5)与等体积的有机溶剂混合。混合物在30℃振荡48小时后，水相中残留的酶活性为上述酶活性。
在两相系统反应中用表达S1基因的大肠杆菌细胞和表达GDH基因的大肠杆菌细胞减少COBE
反应混合物包含15 ml携带pNTG的大肠杆菌HB101的培养液、17 ml携带pNTS1的大肠杆菌HB101的培养液、1.6 mg NADP+、4 g葡萄糖、2.5 g COBE、25 ml乙酸正丁酯和约25mg Triton X-655用5 M氢氧化钠将反应混合物的pH控制在6.5。在2小时时，向反应混合物中加入1.25克COBE和2.5克葡萄糖。为了比较共表达GDH和S1基因的大肠杆菌转化体的反应，将30 ml大肠杆菌培养液
用携带pNTS1G的HB101代替携带pNTG的大肠杆菌HB101和携带pNTS1的大肠杆菌HB101的培养液。其他组件和程序与上述相同。
表达S1基因和GDH基因的大肠杆菌细胞在两相反应体系中的还原反应
该混合物包含65438+25ml具有pNTG质粒的大肠杆菌HB101的细菌液、1017ml具有pNTS1质粒的大肠杆菌HB101的细菌液、1.6mg NADP+、4 g葡萄糖、2。用5M NaOH溶液将pH值控制在6.5。反应两小时后，向混合物中加入1.25克葡萄糖和2.5克葡萄糖。比较GDH和S1基因在大肠杆菌转化细胞中的表达，具有pNTS1G质粒的大肠杆菌HB10130ml取代了具有pNTG和pNTS1质粒的大肠杆菌HB101。其他组件和步骤与上述方法类似。
两相体系反应中COBE还原成(S)-CHBE
反应混合物含有50毫升大肠杆菌HB101转化体的培养液、3.2毫克NADP+、11克葡萄糖、10克COBE、50毫升乙酸正丁酯和约50毫克Triton X-100。在30℃下搅拌反应混合物，用5 M氢氧化钠将pH控制在6.5。分别在3小时和7小时向反应混合物中加入5克COBE/5.5克葡萄糖和10克COBE/ 11克葡萄糖；在26小时时加入3.2毫克NADP+。
两相体系中还原COBE生产(S)-CHBE
反应混合物含有50毫升大肠杆菌HB 101转化的细胞培养液，3.2毫克NADP+，11克
葡萄糖，10gCOBE，50毫升丁酸，约50毫克聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。
在30°C下混合均匀，并用5M NaOH溶液将pH值控制在6.5。第3小时分别加5gCOBE和5.5g葡萄糖或第7小时分别加10gCOBE和11g葡萄糖，第26小时分别加3.2gNADP+。
水体系反应中COBE还原成(S)-CHBE
反应混合物由50毫升大肠杆菌HB101转化体的培养液、3.1毫克NADP+、11克葡萄糖和约50毫克Triton X-100组成。在30℃下搅拌反应混合物。通过微加料机以约0.02克/分钟的速率连续加入15克COBE约65438±02小时。用5 M氢氧化钠将反应混合物的pH控制在6.5。用65438 +000毫升乙酸乙酯萃取反应混合物。有机层用无水硫酸钠干燥，然后真空蒸发。
COBE在水相中还原成(S)-CHBE
反应体系是由50毫升大肠杆菌HB101，3.1 mna DP+，11克葡萄糖和约50毫克聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100转化的菌液。在65438±02小时内，以0.02克/分钟的速率将反应混合物连续加入到30℃的体系中。用5M NaOH溶液将pH值控制在6.5。用100毫升乙酸乙酯萃取反应混合物。用无水硫酸钠干燥有机层，并在真空中脱水。
分析
离心反应混合物得到有机层，通过气相色谱分析CHBE和COBE。如前所述(Yasohara等人，1999)，通过高效液相色谱(HPLC)分析CHB E的光学纯度。
酶和化学品
限制性内切酶和DNA聚合酶购自
塔拉·修佐(日本)。购买了COBE(分子量:164.59)
来自东京化成工业(日本)。外消旋CHBE(分子
重量:166.60)是通过用
NaBH4。使用的所有其他化学品都是分析级的
商用。
分析
通过离心反应混合物获得的有机层的CHBE和COBE通过气相色谱测定。如上所述，通过高效液相色谱分析COBE的光学纯度。
酶和化学试剂
限制性内切酶和DNA聚合酶购自takara公司，COBE(分子量:164.59)购自Tokyo Kasei Kogyo公司，外消旋CHBE(分子量:166.6)由COBE和NaBH4合成。所有其他化学试剂都是分析级和商用试剂。
过量生产S1和GDH的大肠杆菌转化体的构建
为了在同一大肠杆菌细胞中表达羰基还原酶S1和GDH基因，构建了四个表达载体(图1)。质粒pNTS1G和pNTGS1含有来自木兰科木兰的S1基因、来自巨大芽孢杆菌的GDH基因、来自pUC19的lac启动子和来自pTrc99A的终止子。质粒pNTS1含有S1基因、来自pUC19的lac启动子和来自pTrc99A的终止子。大肠杆菌转化体的无细胞提取物中的酶活性如表1所示。携带载体质粒pUCNT的大肠杆菌HB101细胞没有检测到S1或GDH活性。携带pNTS654 38+0G或pNTGS1的大肠杆菌HB101显示S1和GDH活性，而没有异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导。这两个转化体的S1活性低于GDH活性。为了获得其S1活性等于或大于GDH活性水平的转化体，我们使用了低拷贝载体pSTV28 (Homma等，1995；Takahashi等人，1995)，以表达GDH基因。有可能通过降低GDH活性来提高S1活性。质粒pSTVG含有GDH基因、lac启动子、氯霉素抗性基因和来自pACYC184的复制起点，以与质粒pNTS1相容。在携带pNTS65438 +0和pSTVG的大肠杆菌HB101中，S65438 +0活性高于GDH活性，但这种GDH
水平可能太低而不能在如下所述的COBE还原反应中再生。
过量生产S1和GDH的大肠杆菌转化细胞的构建
为了在同一大肠杆菌细胞中表达羰基还原酶S1和GDH基因，需要构建四个表达载体。质粒pNTS1G和pNTGS1含有来自木兰E的S1基因、来自巨大芽孢杆菌的GDH基因、来自pUC19的LAC启动子和来自pTrc99A的终止子。质粒pNTS1含有S1基因。来自大肠杆菌中转化细胞的无细胞提取物的酶活性如表1所示。在携带转运质粒pUCNT的大肠杆菌细胞中不能检测到S1和GDH的活性。携带pNTS1G或pNTGS1的质粒具有S1和GDH的活性，没有IPTG诱导。在两个转化菌株中，S1的活性低于GDH。为了获得S1活性等于或大于GDH的大肠杆菌转化菌株，我们使用低拷贝载体pSTV28表达GDH基因。它可能通过降低GDH的活性来提高S1的活性。质粒pSTVG含有GDH基因、lac启动子、氯霉素抗性基因和来自pACYC184的复制起始位点，其与pNTS1相容。在携带pNTS1和pSTVG的大肠杆菌转化细胞中，S1的活性高于GDH，但GDH的活性可能太低而不能在COBE还原反应中再生。
太长了，字数有限，发不出来。我不在乎分数。我很少登录。这应该算是基因工程吧。之前自己翻译的，不太好。如果你愿意，你可以联系我的电子邮件地址。iamecho23@163.com