蛋白质纯化实验
(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法。
1，蛋白质盐析
中性盐对蛋白质的溶解性有显著影响。一般在低盐浓度下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶。当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度不同程度地降低，并相继沉淀。这种现象被称为盐析。当蛋白质溶液中加入大量的盐时，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)具有很强的水合力，可以抓住蛋白质分子的水合层，使其“脱水”，于是蛋白质胶粒凝结沉淀。盐析时，如果溶液的pH值在蛋白质的等电点，效果更好。由于各种蛋白质分子的粒径和亲水性不同，盐析所需的盐浓度也不同。因此，调节混合蛋白溶液中的中性盐浓度可以分阶段沉淀各种蛋白。
影响盐析的因素有:(1)温度:除温敏蛋白在低温(4度)下操作外，一般可在室温下进行。通常，蛋白质溶解度在低温下会降低。然而，一些蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白)在较高温度(25度)下比在0度下溶解度低，且更容易盐析。(2)pH值:大部分蛋白质在等电点时在浓盐溶液中溶解度最低。(3)蛋白质浓度:当蛋白质浓度较高时，待分离的蛋白质往往与其他蛋白质陆地一起沉淀出来(* * *沉淀现象)。因此，盐析前，应将血清用等量生理盐水稀释，使蛋白质含量为2.5-3.0%。
蛋白质盐析中常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠和磷酸钠。应用最广泛的硫酸铵具有温度系数低、溶解度高的优点(25℃时饱和溶液为4.1M，即767g/L；0℃时的饱和溶解度为3.9M，即676 g/L)。在这个溶解度范围内，许多蛋白质和酶可以盐析出来。此外，硫酸铵的阶段性盐析效果优于其他盐类，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH值通常在4.5和5.5之间。用其他pH值盐析时，需要用硫酸或氨水调节。
蛋白质经过盐析和沉淀分离后，需要将盐从蛋白质中去除。通常的方法是透析，即将蛋白溶液装入袋中进行分析(常用玻璃纸)，用缓冲液透析，不断更换缓冲液。因为透析需要的时间比较长，所以最好在低温下进行。此外，葡萄糖凝胶G-25或G-50也可用于通过柱去除盐，这需要更短的时间。
2、等电点沉淀法
蛋白质处于静电状态时，粒子间的静电斥力最小，所以溶解度最小。各种蛋白质的等电点不同。可以通过调节溶液的pH值达到蛋白质的等电点来沉淀，但这种方法很少单独使用，可以与盐析法结合使用。
3.低温有机溶剂沉淀法
使用与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮，可以降低大多数蛋白质的溶解度并使其沉淀。这种方法的分辨率比盐析法高，但蛋白质容易变性，应在低温下进行。
(2)根据蛋白质分子大小不同的分离方法。
1，透析和超滤
透析是用半透膜将不同分子大小的蛋白质分离。
超滤法是利用高压或离心力迫使水和其他溶质小分子通过半透膜，而蛋白质则留在膜上。可以选择不同孔径的滤膜来截留不同分子量的蛋白质。
2.凝胶过滤法
也称为分子排阻色谱或分子筛色谱，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。柱中最常用的填充材料是Sephadex ged和琼脂糖凝胶。
(3)根据蛋白质的带电性质进行分离。
蛋白质在不同的pH环境中具有不同的带电性质和电荷量，因此可以分离。
1，电泳
在相同的pH条件下，由于分子量和电荷量不同，在电场中的迁移率不同，各种蛋白质可以被分离。值得注意的是等电聚焦电泳，使用一种两性电解质作为载体。在电泳过程中，两性电解质形成从正极到负极逐渐增加的pH梯度。当带有一定电荷的蛋白质在其中游动时，其等电点处的pH位置就停止了。该方法可用于分析和制备各种蛋白质。
2.离子交换色谱法
离子交换剂包括阳离子交换剂(如羧甲基纤维素；CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素；DEAE？FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " & gt；纤维素)，当分离出的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，与离子交换剂电荷相反的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后通过改变pH或离子强度将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见色谱技术一章)
(4)亲和层析，一种基于配体特异性的分离方法。
有限色谱法是分离蛋白质的一种非常有效的方法。从非常复杂的蛋白质混合物中分离出某种蛋白质往往只需要一步，而且纯度非常高。这种方法是基于这样一个事实，即一些蛋白质可以特异性地结合到另一个称为配体的分子上，而不是价。其基本原理是:蛋白质在组织或细胞中以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、纯化和表征是生物化学的重要组成部分。到目前为止，还没有单一的或者一套现成的方法可以从复杂的混合蛋白中提取任何一种蛋白，所以往往是几种方法联合使用！
蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括:
(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法。
1，蛋白质盐析
中性盐对蛋白质的溶解性有显著影响。一般在低盐浓度下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶。当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度不同程度地降低，并相继沉淀。这种现象被称为盐析。当蛋白质溶液中加入大量的盐时，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)具有很强的水合力，可以抓住蛋白质分子的水合层，使其“脱水”，于是蛋白质胶粒凝结沉淀。盐析时，如果溶液的pH值在蛋白质的等电点，效果更好。由于各种蛋白质分子的粒径和亲水性不同，盐析所需的盐浓度也不同。因此，调节混合蛋白溶液中的中性盐浓度可以分阶段沉淀各种蛋白。
影响盐析的因素有:(1)温度:除温敏蛋白在低温(4度)下操作外，一般可在室温下进行。通常，蛋白质溶解度在低温下会降低。然而，一些蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白)在较高温度(25度)下比在0度下溶解度低，且更容易盐析。(2)pH值:大部分蛋白质在等电点时在浓盐溶液中溶解度最低。(3)蛋白质浓度:当蛋白质浓度较高时，待分离的蛋白质往往与其他蛋白质陆地一起沉淀出来(* * *沉淀现象)。因此，盐析前，应将血清用等量生理盐水稀释，使蛋白质含量为2.5-3.0%。
蛋白质盐析中常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠和磷酸钠。应用最广泛的硫酸铵具有温度系数低、溶解度高的优点(25℃时饱和溶液为4.1M，即767g/L；0℃时的饱和溶解度为3.9M，即676 g/L)。在这个溶解度范围内，许多蛋白质和酶可以盐析出来。此外，硫酸铵的阶段性盐析效果优于其他盐类，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH值通常在4.5和5.5之间。用其他pH值盐析时，需要用硫酸或氨水调节。
蛋白质经过盐析和沉淀分离后，需要将盐从蛋白质中去除。通常的方法是透析，即将蛋白溶液装入袋中进行分析(常用玻璃纸)，用缓冲液透析，不断更换缓冲液。因为透析需要的时间比较长，所以最好在低温下进行。此外，葡萄糖凝胶G-25或G-50也可用于通过柱去除盐，这需要更短的时间。
2、等电点沉淀法
蛋白质处于静电状态时，粒子间的静电斥力最小，所以溶解度最小。各种蛋白质的等电点不同。可以通过调节溶液的pH值达到蛋白质的等电点来沉淀，但这种方法很少单独使用，可以与盐析法结合使用。
3.低温有机溶剂沉淀法
使用与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮，可以降低大多数蛋白质的溶解度并使其沉淀。这种方法的分辨率比盐析法高，但蛋白质容易变性，应在低温下进行。
(2)根据蛋白质分子大小不同的分离方法。
1，透析和超滤
透析是用半透膜将不同分子大小的蛋白质分离。
超滤法是利用高压或离心力迫使水和其他溶质小分子通过半透膜，而蛋白质则留在膜上。可以选择不同孔径的滤膜来截留不同分子量的蛋白质。
2.凝胶过滤法
也称为分子排阻色谱或分子筛色谱，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。柱中最常用的填充材料是Sephadex ged和琼脂糖凝胶。
(3)根据蛋白质的带电性质进行分离。
蛋白质在不同的pH环境中具有不同的带电性质和电荷量，因此可以分离。
1，电泳
在相同的pH条件下，由于分子量和电荷量不同，在电场中的迁移率不同，各种蛋白质可以被分离。值得注意的是等电聚焦电泳，使用一种两性电解质作为载体。在电泳过程中，两性电解质形成从正极到负极逐渐增加的pH梯度。当带有一定电荷的蛋白质在其中游动时，其等电点处的pH位置就停止了。该方法可用于分析和制备各种蛋白质。
2.离子交换色谱法
离子交换剂包括阳离子交换剂(如羧甲基纤维素；CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素；DEAE？FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " & gt；纤维素)，当分离出的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，与离子交换剂电荷相反的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后通过改变pH或离子强度将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见色谱技术一章)
(4)亲和层析，一种基于配体特异性的分离方法。
有限色谱法是分离蛋白质的一种非常有效的方法。从非常复杂的蛋白质混合物中分离出某种蛋白质往往只需要一步，而且纯度非常高。这种方法是基于这样一个事实，即一些蛋白质可以特异性地结合到另一个称为配体的分子上，而不是价。其基本原理是:蛋白质在组织或细胞中以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、纯化和表征是生物化学的重要组成部分。到目前为止，还没有一种或一套现成的方法可以从复杂的混合蛋白中提取出任何一种蛋白，因此往往是几种方法联合使用。
蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括:
(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法。
1，蛋白质盐析
中性盐对蛋白质的溶解性有显著影响。一般在低盐浓度下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶。当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度不同程度地降低，并相继沉淀。这种现象被称为盐析。当蛋白质溶液中加入大量的盐时，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)具有很强的水合力，可以抓住蛋白质分子的水合层，使其“脱水”，于是蛋白质胶粒凝结沉淀。盐析时，如果溶液的pH值在蛋白质的等电点，效果更好。由于各种蛋白质分子的粒径和亲水性不同，盐析所需的盐浓度也不同。因此，调节混合蛋白溶液中的中性盐浓度可以分阶段沉淀各种蛋白。
影响盐析的因素有:(1)温度:除温敏蛋白在低温(4度)下操作外，一般可在室温下进行。通常，蛋白质溶解度在低温下会降低。然而，一些蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白)在较高温度(25度)下比在0度下溶解度低，且更容易盐析。(2)pH值:大部分蛋白质在等电点时在浓盐溶液中溶解度最低。(3)蛋白质浓度:当蛋白质浓度较高时，待分离的蛋白质往往与其他蛋白质陆地一起沉淀出来(* * *沉淀现象)。因此，盐析前，应将血清用等量生理盐水稀释，使蛋白质含量为2.5-3.0%。
蛋白质盐析中常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠和磷酸钠。应用最广泛的硫酸铵具有温度系数低、溶解度高的优点(25℃时饱和溶液为4.1M，即767g/L；0℃时的饱和溶解度为3.9M，即676 g/L)。在这个溶解度范围内，许多蛋白质和酶可以盐析出来。此外，硫酸铵的阶段性盐析效果优于其他盐类，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH值通常在4.5和5.5之间。用其他pH值盐析时，需要用硫酸或氨水调节。
蛋白质经过盐析和沉淀分离后，需要将盐从蛋白质中去除。通常的方法是透析，即将蛋白溶液装入袋中进行分析(常用玻璃纸)，用缓冲液透析，不断更换缓冲液。因为透析需要的时间比较长，所以最好在低温下进行。此外，葡萄糖凝胶G-25或G-50也可用于通过柱去除盐，这需要更短的时间。
2、等电点沉淀法
蛋白质处于静电状态时，粒子间的静电斥力最小，所以溶解度最小。各种蛋白质的等电点不同。可以通过调节溶液的pH值达到蛋白质的等电点来沉淀，但这种方法很少单独使用，可以与盐析法结合使用。
3.低温有机溶剂沉淀法
使用与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮，可以降低大多数蛋白质的溶解度并使其沉淀。这种方法的分辨率比盐析法高，但蛋白质容易变性，应在低温下进行。
(2)根据蛋白质分子大小不同的分离方法。
1，透析和超滤
透析是用半透膜将不同分子大小的蛋白质分离。
超滤法是利用高压或离心力迫使水和其他溶质小分子通过半透膜，而蛋白质则留在膜上。可以选择不同孔径的滤膜来截留不同分子量的蛋白质。
2.凝胶过滤法
也称为分子排阻色谱或分子筛色谱，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。柱中最常用的填充材料是Sephadex ged和琼脂糖凝胶。
(3)根据蛋白质的带电性质进行分离。
蛋白质在不同的pH环境中具有不同的带电性质和电荷量，因此可以分离。
1，电泳
在相同的pH条件下，由于分子量和电荷量不同，在电场中的迁移率不同，各种蛋白质可以被分离。值得注意的是等电聚焦电泳，使用一种两性电解质作为载体。在电泳过程中，两性电解质形成从正极到负极逐渐增加的pH梯度。当带有一定电荷的蛋白质在其中游动时，其等电点处的pH位置就停止了。该方法可用于分析和制备各种蛋白质。
2.离子交换色谱法
离子交换剂包括阳离子交换剂(如羧甲基纤维素；CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素；DEAE？FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " & gt；纤维素)，当分离出的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，与离子交换剂电荷相反的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后通过改变pH或离子强度将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见色谱技术一章)
(4)亲和层析，一种基于配体特异性的分离方法。
有限色谱法是分离蛋白质的一种非常有效的方法。从非常复杂的蛋白质混合物中分离出某种蛋白质往往只需要一步，而且纯度非常高。这种方法是基于这样一个事实，即一些蛋白质可以特异性地结合到另一个称为配体的分子上，而不是价。其基本原理是:蛋白质在组织或细胞中以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、纯化和表征是生物化学的重要组成部分。到目前为止，还没有一种或一套现成的方法可以从复杂的混合蛋白中提取出任何一种蛋白，因此往往是几种方法联合使用。蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括:
(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法。
1，蛋白质盐析
中性盐对蛋白质的溶解性有显著影响。一般在低盐浓度下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶。当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度不同程度地降低，并相继沉淀。这种现象被称为盐析。当蛋白质溶液中加入大量的盐时，高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)具有很强的水合力，可以抓住蛋白质分子的水合层，使其“脱水”，于是蛋白质胶粒凝结沉淀。盐析时，如果溶液的pH值在蛋白质的等电点，效果更好。由于各种蛋白质分子的粒径和亲水性不同，盐析所需的盐浓度也不同。因此，调节混合蛋白溶液中的中性盐浓度可以分阶段沉淀各种蛋白。
影响盐析的因素有:(1)温度:除温敏蛋白在低温(4度)下操作外，一般可在室温下进行。通常，蛋白质溶解度在低温下会降低。然而，一些蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白)在较高温度(25度)下比在0度下溶解度低，且更容易盐析。(2)pH值:大部分蛋白质在等电点时在浓盐溶液中溶解度最低。(3)蛋白质浓度:当蛋白质浓度较高时，待分离的蛋白质往往与其他蛋白质陆地一起沉淀出来(* * *沉淀现象)。因此，盐析前，应将血清用等量生理盐水稀释，使蛋白质含量为2.5-3.0%。
蛋白质盐析中常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠和磷酸钠。应用最广泛的硫酸铵具有温度系数低、溶解度高的优点(25℃时饱和溶液为4.1M，即767g/L；0℃时的饱和溶解度为3.9M，即676 g/L)。在这个溶解度范围内，许多蛋白质和酶可以盐析出来。此外，硫酸铵的阶段性盐析效果优于其他盐类，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH值通常在4.5和5.5之间。用其他pH值盐析时，需要用硫酸或氨水调节。
蛋白质经过盐析和沉淀分离后，需要将盐从蛋白质中去除。通常的方法是透析，即将蛋白溶液装入袋中进行分析(常用玻璃纸)，用缓冲液透析，不断更换缓冲液。因为透析需要的时间比较长，所以最好在低温下进行。此外，葡萄糖凝胶G-25或G-50也可用于通过柱去除盐，这需要更短的时间。
2、等电点沉淀法
蛋白质处于静电状态时，粒子间的静电斥力最小，所以溶解度最小。各种蛋白质的等电点不同。可以通过调节溶液的pH值达到蛋白质的等电点来沉淀，但这种方法很少单独使用，可以与盐析法结合使用。
3.低温有机溶剂沉淀法
使用与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮，可以降低大多数蛋白质的溶解度并使其沉淀。这种方法的分辨率比盐析法高，但蛋白质容易变性，应在低温下进行。
(2)根据蛋白质分子大小不同的分离方法。
1，透析和超滤
透析是用半透膜将不同分子大小的蛋白质分离。
超滤法是利用高压或离心力迫使水和其他溶质小分子通过半透膜，而蛋白质则留在膜上。可以选择不同孔径的滤膜来截留不同分子量的蛋白质。
2.凝胶过滤法
也称为分子排阻色谱或分子筛色谱，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。柱中最常用的填充材料是Sephadex ged和琼脂糖凝胶。
(3)根据蛋白质的带电性质进行分离。
蛋白质在不同的pH环境中具有不同的带电性质和电荷量，因此可以分离。
1，电泳
在相同的pH条件下，由于分子量和电荷量不同，在电场中的迁移率不同，各种蛋白质可以被分离。值得注意的是等电聚焦电泳，使用一种两性电解质作为载体。在电泳过程中，两性电解质形成从正极到负极逐渐增加的pH梯度。当带有一定电荷的蛋白质在其中游动时，其等电点处的pH位置就停止了。该方法可用于分析和制备各种蛋白质。
2.离子交换色谱法
离子交换剂包括阳离子交换剂(如羧甲基纤维素；CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素；DEAE？FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " & gt；纤维素)，当分离出的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，与离子交换剂电荷相反的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后通过改变pH或离子强度将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见色谱技术一章)
(4)亲和层析，一种基于配体特异性的分离方法。
有限色谱法是分离蛋白质的一种非常有效的方法。从非常复杂的蛋白质混合物中分离出某种蛋白质往往只需要一步，而且纯度非常高。这种方法是基于这样一个事实，即一些蛋白质可以特异性地结合到另一个称为配体的分子上，而不是价。其基本原理是:蛋白质在组织或细胞中以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、纯化和表征是生物化学的重要组成部分。到目前为止，还没有一种或一套现成的方法可以从复杂的混合蛋白中提取出任何一种蛋白，因此往往是几种方法联合使用。
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