有关于RNA干扰的论文吗？
RNA干扰；高血压；血管紧张素ⅱ受体；载体
高效shRNAs靶向大鼠AT1受体的基因沉默及其筛选
摘要目的:研究短发夹RNA(shrna)对哺乳动物细胞中大鼠血管紧张素ⅱ1(at 1)受体基因表达的调节作用，并探讨高效shrna的特征与shrna功能的相关性。方法:构建4个针对大鼠血管紧张素ⅱ受体的shRNAs表达载体。shRNAs靶向同一基因的4个不同区域。用构建的pGenesil1shRNA质粒和scrambled质粒转染ra t C6胶质瘤细胞。在不同阶段收集培养的细胞用于RTPCR和蛋白质印迹分析。结果:24小时后，所有处理组的AT1 mRNA水平均无显著降低。48小时后，铅处理组AT1 mRNA水平降至对照组的(55.7±7.6)%，72小时后达到最低点(43.7±8.2)%。其他各组对AT1受体mRNA表达无明显抑制作用(P>0.05)。AT1 mRNA和蛋白质水平最终表现相似。在第24小时和第48小时，AT1蛋白与对照组相比分别为(46.9±4.2)%和(37.0±3.7)%，并且在温育72小时后观察到最大减少量〔与对照组相比为28.1±4.0)〕。结论:除了一些一般的规则，我们相信siRNA靶向区域的mRNA的环结构和靶向mRNA的siRNA的更好的可及性确实对沉默有很强的影响。
关键词RNAi高血压；血管紧张素ⅱ受体；矢量
目的:研究shRNA在哺乳动物细胞中调节大鼠血管紧张素ⅱ 1受体基因表达的有效性，并探讨有效shRNA的特征与shRNA功能的关系。方法:设计并构建4个针对大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体，转染大鼠胶质瘤C6细胞，并在不同时间收集转染细胞。进行RTPCR和Western blot。结果:转染24小时后，AT 1的mRNA水平在所有处理组中没有显著降低。与对照组相比，转染后48h，Pb组血管紧张素ⅱ受体mRNA水平下降至(55.7±7.6)%。72 h后达到最低点(43.7±8.2)%。其他各组AT1受体mRNA表达无明显抑制作用(P > 0.05)。抑制大鼠血管紧张素ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果相似。与对照组相比，染铅组血管紧张素ⅱ受体蛋白在24 h和48 h分别降至(46.9±4.2)%和(37)。转染后72 h最大减少量为(28.1±4.0)%±4.0)%。结论:除一般原理外，靶mRNA的环状结构和shRNA能否到达靶位对基因干扰实验的成功起着重要作用。
RNA干扰；高血压；血管紧张素ⅱ受体；载体
基因干扰可以特异性降解目的基因的RNAi，从而降低或沉默目的基因在组织或细胞中的表达[1]。选择并合成编码大鼠AT1R mRNA短发夹RNA(shRNA)的几个单链核苷酸，退火形成双链结构，并克隆到质粒载体中。在构建了编码AT1R shRNA的四个表达载体后，转染C6细胞。根据不同核苷酸序列的shRNA质粒在哺乳动物细胞中的功能表达，研究了它们对沉默大鼠AT1R靶向作用的差异。
1材料和方法
1.1质粒购自武汉京赛生物工程技术有限公司，限制性内切酶BamH、Hind、Sal、Pst购自大连宝生物工程有限公司；T4 DNA连接酶和缓冲液购自New England Biolabs公司。大鼠脑胶质瘤细胞系C6细胞购自中国典型标本馆；细胞培养基DMEM购自Hyclone公司。转染试剂Metafectamine购自德国Biotex。所有的DNA合成和引物合成服务由上海博雅生物技术有限公司提供
1.2方法
构建GenBank中1.2.1目的基因AT1R mRNA的shRNA，选取大鼠AT1R(序列号NM_030985)的基因序列，用在线设计软件siRNA打靶仪选取长度为21核苷酸以TT结尾的序列。GC含量最多不超过60%。具有四个或更多个连续A或T碱基的靶基因的四个核苷酸序列被BLAST消除和验证，并且编码shRNA序列的正向和反向序列单链DNA被化学合成如下:一对非特异性序列被同时设计用于靶基因核苷酸序列作为阳性对照。将合成的shRNA序列退火，与线性化的pGenesil1质粒连接，转化阳性克隆，经Pstⅰⅰ和Salⅰⅰ酶切和测序鉴定。上述不同的靶基因序列质粒分别称为pGenesilA(Pa)、pGenesilB(Pb)、pGenesilC(Pc)和pGenesilD(Pd)。
1.2.2细胞培养和转染培养板以2×108/L的密度接种相同数量的细胞，按照试剂提供者的转染方案以1∶6的比例转染细胞。
1.2.3 RTP Crat1基因的引物序列为:5’tgttcctcttccttatcatttct 3’，5’ctttgcttggttact。
CCT TCA 3’和内参GAPDH的引物序列分别为:5’ttcaaggcacagtcaag 3’，5’ttagtggggtct。
CGC TCC 3’。25 μL反应体积包括5 μL cDNA，每条引物为0.25 μL，1.5 μL MgCl2，0.25 μL Taq DNA聚合酶，0.5 μL dNTP混合物，5 μL 10×缓冲液。反应条件为:在94℃退火3 min后，在94℃退火65438。在55℃ 15 s和72℃ 15 s下循环30次后，产物进行琼脂糖凝胶电泳。
1.2.4 Western blot分析显示，转染pGensilAT1shRNA质粒和对照质粒后不同时间收获C6细胞。用PBS溶液洗涤后，通过加载缓冲溶液溶解细胞。将溶液煮沸65438±00分钟后，离心上清液，弃去沉淀物。测定蛋白质浓度。通过电泳分离细胞裂解物。50 g/L脱脂乳密封后，加入抗AT1抗体(1∶1000)和抗β肌动蛋白抗体(1∶1500)，室温孵育1.5 h，再加入第二抗体(抗兔HRP)。
统计处理:根据RTPCR和Western Blot分析结果，用图像处理软件ImageTool 3.0测量灰度值，相对值与内参比较。采用统计软件SPSS 11.5进行组间方差分析。显著性水平为p < 0.05。
2个结果
2.1不同shRNA表达质粒靶标及二级结构我们选取了大鼠血管紧张素ⅱ受体mRNA序列的部分序列，即556~575 bp、469~488 bp、595~614 bp、663~682 bp，作为基因沉默靶标(图1)，构建了四个序列。
除了3’端缺少两个连续的胸苷外，AT1shRNA的正义链与大鼠AT1基因的靶基因序列相同，反义链与靶序列互补。其转录产生的RNA预计会折叠成短发夹状siRNA。理论上，转录的shRNA应该能够切割靶基因mRNA，但是改组的对照质粒不应该用于at 65438。
2.2 AT1 mRNA水平和蛋白表达用四组阳性质粒转染24 h后，各组AT1 mRNA水平无明显下降。48 h后，与对照组相比，转染Pb质粒组AT1 mRNA表达水平下降至(55.7±7.6)%。重组siRNA转染的C6胶质瘤细胞中AT1受体mRNA的表达水平未被显著抑制(P & gt0.05).结果表明，Pb质粒明显抑制AT1受体mRNA的表达，而其他三组质粒对抑制AT1受体mRNA无明显作用(图3和图4)。Western Blot分析对AT1受体mRNA具有有效抑制作用的Pb质粒。在24 h和48 h，AT1蛋白的表达分别为(46.9±4.2)%和(37.0±3.7)%。与对照组相比，转染后72 h最大表达量下降(仅为对照组的(28.65438±0.4)%。结果显示，转染Pb质粒的细胞，AT1的蛋白水平降低，但转染shuffled shRNA质粒和对照组不能降低AT1基因的表达(图5)。所有结果清楚地表明转染Pb质粒可以抑制AT1基因的表达。
3讨论
血管紧张素ⅱ是肾素血管紧张素系统的主要效应分子，具有调节血压、水钠平衡、神经功能等作用。研究证实，血管紧张素ⅱ参与动脉硬化、心肌梗死、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理过程。血管紧张素ⅱ通过直接激活AT1R，间接刺激一些生长因子和细胞因子的释放来诱导心肌细胞。血管细胞肥大和增殖[2]。同时还能刺激AT2，激活与AT1相反的生物效应，导致血管舒张，缓激肽生成增加，抑制纤维化和血管重塑[3]。本研究构建了AT1的短发夹RNA表达质粒，利用基因沉默技术抑制哺乳动物细胞中AT1 mRNA的表达，希望能阻断AT65438+。
实验结果表明，AT1基因的mRNA表达在早期下降，相应的蛋白也随着mRNA水平的抑制而下降。结果表明，U6启动子驱动的shRNA序列能有效且特异性地抑制AT1基因在转染的C6细胞中的表达。因此，shRNA的表达可以抑制细胞中与高血压病理生理相关的AT1基因的表达。
目前，没有* * *的意见或标准选择siRNA序列[5]。为了优化siRNA诱导的基因沉默的效率，许多研究小组研究了siRNA双链的长度、二级结构和序列特异性。一般认为[6]，siRNA序列应选择在目的基因起始密码子下游100个碱基之后。siRNA的序列应该避开起始密码子的5’或3’非编码区。正义链的序列应该是AA(N19)TT，其中N代表任何核苷酸，即选择的siRNA应该有两个尿嘧啶核苷的3’突出端。所选siRNA的长度应为21个核苷酸。决定RNA干扰研究成功与否的因素还有很多。包括靶位点在mRNA三级结构中的位置，转染效率和双链shRNA的特异性[7-8]。在比较本实验设计的四个质粒时，我们注意到Pc和Pd的靶向切割位点都位于目的基因mRNA二级结构的核心位置，尤其是Pd。这可能是质粒转染产生的短发夹RNA与RISC (RNA诱导基因沉默复合物)结合后无法进入靶mRNA切割位点，导致实验失败的原因之一。而Pa和Pb的靶向切割位点位于目的基因mRNA的二级结构表面，但质粒Pa也是无效的。可能的原因有:①质粒Pa的低GC含量会导致目的基因mRNA识别效率的降低；②与RISC杂交的效率降低。此外，我们还发现Pb质粒切割的靶基因的局部二级结构比Pa质粒切割的要松散，即前者靶位点的氢键相对弱于后者。在这些因素中，我们认为最重要的因素是siRNA是否能进入靶位点，靶位点mRNA的结构是否足够松散，以允许靶向切割siRNA和RISC复合物。
总之，在设计短发夹RNA时，除了目标序列要在开放阅读框内，不要选择非编码区；GC含量应在50%左右；避免起始密码子后至少100个碱基；除了寻找5′aa(n 19)序列，进行BLAST等一些通用规则外[9]，我们认为siRNA能否进入靶切割位点，靶位点的二级结构是否疏松，是有效shRNA的合理设计和实验成功的最重要因素。
参考
〔1〕 Fire A，Xu S，Montgomery MK，等.双链RNA对秀丽隐杆线虫的有效和特异的遗传干扰〔J〕自然，1998，391(6669):806-811。
〔2〕 Dinh DT，Frauman AG，Johnston CI，等.血管紧张素受体:分布、信号传导和功能〔J〕Clin Sci(Lond)，2001，100(5): 481-492。
〔3〕征毕。血管紧张素ⅱ2型受体会对心血管疾病产生有害影响吗？肾素-血管紧张素系统治疗阻断的意义。发行量，2004，109(1): 8-13。
〔4〕 Esler M .交感神经系统与高血压〔J〕。美国高血压杂志增刊，2000年，13(6):99S-105S。
〔5〕 Wadhwa R，Kaul SC，Miyagishi M，等. RNA干扰技术及其在研究和治疗中的应用〔J〕Mutat Res，2004，567(1):71-84。
〔6〕 Miyagishi M，Hayashi M，Taira K .反义寡核苷酸和siRNAs对哺乳动物细胞中相同靶标抑制作用的比较〔J〕反义核酸药物开发，2003，13(1): 1-7。
〔7〕 Miyagishi M，Taira K表达载体的开发和应用〔J〕核酸研究补编，2002，(2):113-114。
〔8〕 Hamada M，Ohtsuka T，Kawaida R，等.错配和在siRNAs的30末端引入化学修饰对培养的哺乳动物细胞中基因表达(RNAi)的RNA干扰的影响〔J〕反义核酸药物开发，2002，12(5): 301-309。
〔9〕 Elbashir SM，Harborth J，Weber K，等.利用小干扰RNA分析哺乳动物体细胞的基因功能〔J〕方法，2002，26(2): 199-213。