组织培养实验研究方案

如何选择最佳培养方案

当植物组织培养的理论内容应用到具体的植物和大家所面临的实验条件时，会出现一些问题，比如如何协调各个环节，如何选择一些最优条件，如何判断工作中的情况是否正常，如何克服不利影响，如何诱导培养物向我们希望的方向发展等等。下面将介绍一些解决上述问题的方法，即提出问题，设计实验，通过实验结果的分析找到答案。大多数情况下，很多实验方法要结合自己的工作经验灵活运用。

在介绍每个单因素的选取之前，先简单说明一下常用的测试方法。

(一)、植物组织培养中常用的试验方法

1，初步测试

如果你对某一种植物感兴趣，或者对某一个因素有疑问，或者看完一篇论文想到自己实验中的类似问题，可以简单拟定一个方案，大致判断这个因素是否有影响。○2如果有，其大致程度和数量如何？以上两个问题，大致测试一下就能判断出来，基本可以达到预期目的。那么，我们就可以遵循预备试验的路径，设计出比较完整的实验方案，获得了准确可靠的实验数据，加深了对问题的认识。

初试要求比较低，不需要深思熟虑，要求严格，往往是灵机一动。一旦满足了植物组织培养的条件，你可以做很多工作，只要放在那里观察培养物的反应，有反应了再做。通常越是有经验的人，判断越准确。是因为预备实验命中率更高，能尽快找到科研的突破口，从而扩大成果。

前期试验规模小，条件不需要全面。在能量允许的情况下多做预备实验，可以加快进度。初步测试的否定结果也是非常有用的信息，可能说明问题不在这方面，或者问题不简单，也会加深研究的思路。总之，预备实验消耗的时间精力少，问题直截了当，可以让下一阶段的工作更有把握。很多正式的研究往往需要做一些预备实验，找出影响因素及其水平。

2.单因素试验

在单因素实验中，所有的条件和因素都维持在一般水平，只改变一个因素，找出这个因素对实验的影响和程度。例如MS培养基，其他成分和剂量不变，仅NAA的剂量在0，0.1，0.5，1.0 mg/1之间变化，以找出NAA剂量对一个培养物生根的影响。这是单因素试验。单因素实验，除了要研究的一个变量外，都要相同或尽可能接近，实验要安排得非常简单。一次改变一个因素，详细记录整个情况。通常在初步测试后，可以安排更全面的单因素测试，以确定该因素与测试结果之间的定量关系。

生物实验与物理或化学实验有许多不同之处。最重要也是最显著的区别是，生物实验需要设立对照组和实验组。实验组可以有一个或几个组，随着实验复杂程度的增加，对照组可以有多个组。要求对照组和试验组的试验个体，即植物组织块或其他培养物，在遗传、生理状态、预培养条件等方面必须尽可能完全一致。(这在组织培养中更容易做到)。这是因为生物研究对象的可变因素太多，很多东西很难直观地记录下来，并转化为数字。测试材料的来源不纯且不规则，如果将来发生变化，将无法确定是由于测试因素的影响还是材料之间差异的结果。对照组通常不应用测试因子或维持原始培养条件。

在每个治疗项目中，通常会用到一定数量的试验材料，所以一定要有一定数量的重复。根据实验的规模和要求，大部分项目要有4-10瓶，每瓶至少要有3个培养物或3个小苗。这些材料的数量和质量应尽可能保持一致。重复次数越多，实验越仔细，结果越可靠。得到的测试结果要经过适当的数学处理，这样才能客观地判断测试结果的准确性和可信度。

3.多因素实验和正交设计

近年来，在现代统计学和其他数学方法的帮助下，设计复杂的实验来同时测试几个因素已经成为可能。这已经显示出显著的优点，即节省时间和精力，同时提供交互中几个可变因素的效果。比如用正交设计，用L9表时，可以安排四个因素，三个水平的实验，一个* * *做九个不同组合的实验，结果相当于做了27个不同组合的实验。虽然正交实验是许多因素的组合，但在对实验结果的分析中，每个因素所起的作用都可以清楚地表现出来。所以一个系统的测试结果，可以清晰的分析问题，在有限的时间内获得多重的收获。在植物快速繁殖的研究中，可用于同时探索培养基中几种成分的适宜用量，如细胞分裂素、生长素、糖等成分。当培养物有了便于观察和计算的实用可靠的指标，即便于进行定量处理时，多因素实验就能起到推动试验进程的作用，事半功倍。比如苗数、苗高、根数、根长、移栽成活率等等。

在没有上述明确的可数指标的情况下，如愈伤组织的生长状态、生长量、分化潜力等，我们可以根据经验直观观察，利用评价打分的方法，将状态和质量指标转化为数字，然后进行统计处理。严格来说，上述指标经过仔细的测定和分析，也是可以量化的。比如愈伤组织的生长可以先称空瓶(有培养基)，接种后再称。两个重量之差就是初始接种物的初始重量。培养一段时间后，先取出培养物(因为无菌称重不方便，如果培养物没有保存，可以直接称重)，用称重瓶转移到新鲜培养基中，然后在称量瓶中称重，找出培养物的最终重量。初始重量的差异是培养物的生长。您也可以设置一个控件并称量干重。可见手续很麻烦。当涉及到分化状态和潜能时，也可以通过制备切片，在显微镜下观察来确定实用的定量指标，但上述过程只能用于有价值的理论研究。在大多数应用项目中，过于繁琐，没有实用价值。凭经验判断评分方法，误差系数太大。所以，在这种没有具体数值指标的实验中，最好用单因素实验来说明问题。否则，各种因素的作用交织在一起，往往会使结果无法解释。

4、逐步增加和逐步取消测试方法

在植物组织分化和再生的研究中，往往在达到可靠的分化和再生之前就加入各种有机营养物质，而在稳定的再生之后，这些成分就可以逐渐减少。逐步添加时是为了使实验成功，逐步减少时是为了缩小范围以便找到影响最大的因素，或者是为了实际需要简化培养基，以降低成本，便于推广。这种简单的加减乘除法，在寻求最佳激素配比时经常用到。

(2)主要培养条件和影响因素的选择

1，基本培养基的选择

在试管繁殖成功的植物种类中，MS是最基本的培养基。所以在一般文化中，可以先尝试。如果发现有不良影响或者不理想，如果要改进基础培养基，最好先降低MS培养基的浓度。其次，可以选择与MS培养基成分显著不同的其他培养基进行试比较，如B5、White、Nitsch培养基等。通常微量元素和铁盐不需要做成很多种，只要按照MS微量元素的配方就可以了，可以用在其他培养基成分中。混合微量元素的浓度一般为每升培养基1毫升或5毫升。达到稳定分化增殖时，微量元素可减少甚至省略。配方中微量元素的用量也大相径庭。比如在ER培养基中的用量，在MS配方中只有1/10。培养基中的有机成分变化最大，不必拘泥于某个配方的要求。当遇到难以区分的材料时，往往是增加培养基的复杂程度，不断添加可能有前途的营养物质或生理活性物质，培养成功后再逐渐减去。所以可能会发现有些成分其实是促进检测结果的无关因素。但其中一些起到了促进作用。实验不成功的时候，加总比不加好，而且大部分有机成分的用量不能太高，比如生物素，一般是0.01-0.1 mg/1。有些有机物是植物组织生长和分化的必需物质，是代谢环节中的电子转运体。在全株内可自行合成，但在离体组织内，由于伤口面积急剧增大，代谢消耗加强，合成减少或无法合成，或供给不足。所以即使很少添加，有没有也是不一样的。

选择基本培养基的例子:月季丛生苗分别接种在MS、B5、White培养基上，除基本无机盐配方外，这三种培养基的成分均相同。经过1个月的培养，可以看出一点变化。第二个月转一次继续培养，第三个月再转一次。这样，在第三个月末或第四个月初，就可以看到这三种基质对月季苗生长和观赏的效果。其中MS培养基最好，幼苗生长快，增殖高。B5中等差；白色培养基最差，生长缓慢，增殖率低。测试结果显示MS为100%，B5约为86%，White约为73%。这样，可以选择MS培养基作为月季离体繁殖的基本条件。在这个例子中，三种培养基是对照组，或者MS处理的培养基是对照组。

2.植物激素配比的选择

根据植物组织培养文献积累的资料，选择植物激素的种类，调整细胞分裂素和生长素的用量，是植物组织分化和幼苗快速生长的最重要环节。形象地说，这是最灵敏的旋钮。

在选择或暂时确定一种基本培养基后，或者同时，通常首先考虑的是植物激素的比例。例如，使用MS培养基，BA用于细胞分裂素，NAA用于生长素。剂量:BA暂定为2mg/1，NAA暂定为0.1或0.2mg/1。现在，这样的介质通常被写成MS+Ba2+NAA 0.1-0.2。培养温度24-26℃，日光照10小时。这种培养基和条件已经成功分化增值了几百株容易再生的植物，不妨先试一试。

培养一段时间后，可以根据大多数培养物和少数组织块的表现来修改下一个培养基中植物激素的量。这个过程就是收集培养物对培养基和培养条件的“意见”。文化的各种表现说明了什么问题，如何调整，后面会详细介绍。

初步测试可能不止一个，比如:MS+BA1+NAA0.1，MS+BA3+NAA0.1等。如果培养反应不理想，可以查阅和参考相近科、属、属中其他物种的培养条件。

不同激素用量的选择也可以通过两组单因素试验进行:第一组找出BA的适宜用量，第二组找出NAA的适宜用量。

第一组是1—1ms+ba 1+NAA 0.1。

1—2毫秒+BA2+NAA0.1

1—3毫秒+BA4+NAA0.1

在这组实验中，NAA的用量不变，但要观察BA对培养的影响。

第二组是2-1ms+Ba2+NAA0.05。

2-2 MS+BA2+NAA0.1

2-3 MS+BA2+NAA0.5

在这组实验中，BA的剂量保持不变，并观察NAA对培养物的影响。

像这样一个简单的实验不需要英航和NAA同时改变。从测试结果来看，可以选择一到两个较好的处理，也可以预测最后两组测试中没有出现的组合，测试需要调整后再继续。比如上面实验中1-2更好，2-3更好。重复实验时，可选择MS+BA2+NAA0.5的激素配比。

还可以预选测量水平变化较大的测试，形象地说就是筛选的“筛孔”更粗，检测范围更广。比如BA选1，3，5mg/1；NAA为0.05、0.5和5mg/1；或者0.01，0.1，1，5.0mg/1等等。这组实验结果明确后，最佳组合是设计新的组合，降低数量级。经过两三轮实验，就会找到最佳的激素组合。

对许多植物来说，这样的实验就足够了。特殊情况下，如不能解决问题，可进一步选用KT、ZT、2-ip等其他细胞分裂素，IAA、IBA、2，4-D等其他生长素，采用正交试验和优选法安排多因素试验。经过精心耐心的实验，包围圈逐渐缩小，终于找到了合适的细胞分裂素和生长素的种类和用量，使植株得以顺利高速繁殖。

应该记住，所有的实验都应该在相同的培养基上重复2-3次，以确认它们的效果。如果少量测试材料在完全不同的介质上周转，测试结果无法分析，无法提供真实数据。最好的办法就是加大工作量，重新开始，多消毒多接种样本，仔细检测观察。

3.糖浓度的选择

通过单因素试验或正交试验，结合植物激素的选择，确定了最佳糖浓度。通常选择的范围很小。对于大多数植物来说，合适的浓度是20或30g/1，在某些情况下是40g/1。在花药培养中，差异较大，有时为70-150g/1。

4.pH值的选择

一般植物对PH值要求不严格，如山茶、杜鹃、三角梅等，PH值可以降到5.4或5.0。在尝试新的栽培物种时，我们可以参考过去发表的类似植物。通过使用仅改变PH值的单因素试验，可以快速知道合适的PH值。第一次尝试PH5.0，5.4，5.8，6.2。第一次结果出来后，再次微调，确定最佳PH值。

在培养过程中，培养基的PH值会随着营养物质的消耗而变化，所以当数量级差异过小时，实验结果的差异并不明显。只要培养物的生长和观赏性能够满足快繁的要求，就不必太过小心。

5.温度和照明

在没有特殊设备的情况下，温度和光照要求的选择不需要太详细。利用培养架的顶部、中部和底部，分别放置培养瓶和温度计，培养一段时间后，可以比较植物需要的温度范围。对光强的需求可以通过植物和光源之间的距离来比较。没有特殊需要，一般不研究光周期，多数专家认为10-14小时光照是必要的。

有条件的单位可以购买轻型保温箱。这种设备可以精确控制每天的光照时间，即光照和黑暗的周期性变化可以任意控制，光照强度可以通过灯的数量来调节。配有加热和冷却装置，可调节到+1℃的任何范围。光照培养箱是研究培养物春化处理和光周期对植物发育影响的理想设备。箱内湿度一般只能调节，但这个关系不是很重要，因为培养瓶内湿度一般是100%。如果运用得当，在这样的实验条件下，可以影响植物生长发育的几个最重要的因素都被人为控制了。这是一种可以在微观整体水平、组织或器官水平和细胞水平进行精确控制的理想设备。有了这种光照培养箱，你就可以方便快捷地找出某种植物快速繁殖所需的最佳温度和光照条件。

6、综合因素的最终确定

找到各个单因素的最佳条件后，将这些最佳条件组合在一起进行综合实验，根据实验结果可以结束实验工作，将研究成果推广应用于大规模快速繁殖。