关于ECAP的论文
目的探讨卡那霉素与速尿合用对豚鼠耳蜗的毒性作用。方法实验组25只豚鼠肌肉注射卡那霉素500 mg/kg，2h后静脉注射速尿50 mg/kg，对照组4只豚鼠。给药后第7天，用听觉脑干诱发电位仪检测实验组和对照组豚鼠的听觉功能。用免疫荧光染色法和常规切片法对阈大于95 dB SPL的豚鼠耳蜗进行了观察，并用扫描电镜对耳蜗进行了观察。结果实验组13只豚鼠的ABR测试阈值高于95 dB SPL。对聋豚鼠进行观察，发现毛细胞和神经纤维明显受损，尤其是第一、二耳蜗。结论卡那霉素联合呋塞米可造成豚鼠毛细胞和神经纤维的严重损伤，是一种快速有效的建立耳聋模型的方法。
卡那霉素；呋塞米；听觉脑干诱发电位；耳蜗组织病理学；免疫荧光
摘要目的探讨卡那霉素与袢利尿剂速尿合用对豚鼠的耳毒性。方法豚鼠肌肉注射KM(500mg/kg ), 2h后静脉注射速尿(50 mg/ kg)。给药后第7天记录听觉脑干反应(ABRs)以监测动物的听力。光镜和扫描电镜观察免疫组化和组织病理学变化。结果随后的ABR监测显示深度听力损失为双侧性和永久性。组织病理学检查显示基底耳蜗内、外毛细胞缺失。神经纤维损伤的程度也存在于基底耳蜗，并依赖于震耳欲聋手术后的存活时间。结论KA和速尿联合应用能有效地造成豚鼠的深度听力损失，是一种有效的急性动物实验的致聋方法。
关键词卡那霉素(KM)；呋塞米；听觉脑干反应；；耳蜗组织病理学
联合应用肌肉注射卡那霉素(KM)和尿酸(EA)建立动物耳聋模型的优点是单次给药致聋，不刺激耳蜗或圆窗[1]。卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，其内耳毒性的临床和实验研究已有报道。速尿是一种袢利尿剂。呋塞米耳毒性的实验研究表明[2]呋塞米可引起血管纹边缘细胞的病理改变。我们前期的实验用听觉脑干反应等测试证明，KM和ea结合后三天豚鼠的听觉功能受到严重损害[3]。本研究采用冰冻切片、琥珀酸脱氢酶(SDH)染色、免疫荧光染色和扫描电镜技术，从内耳病理形态学角度评价卡那霉素联合呋塞米对豚鼠耳蜗的毒性作用。
1材料和方法
1.1动物分组
健康成年白色红眼豚鼠29只，耳廓反应敏感，雌雄不限，体质量250 ~ 300g(由解放军总医院实验动物中心提供)，随机分为两组，实验组25只，空白对照组4只。
1.2动物用药
实验组豚鼠股内侧肌肉注射硫酸卡那霉素500 mg/kg一次，2小时后注射呋塞米:麻醉动物股内侧肌肉注射速眠新0.01 ml /kg，术中暴露1条颈静脉，30秒内按50 mg/kg注射呋塞米[3]。
硫酸卡那霉素:250000单位/ml，天津制药焦作有限公司生产，批号:06051531；呋塞米:10 mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司生产，批号:0606191。素面馨:1.5 ml，解放军军需大学畜牧研究所提供。其主要成分为氟哌啶醇、新眠灵、氯胺酮。
1.3听性脑干反应阈值试验
两组豚鼠在服药7天后，用美国智听公司的智能听力系统Smart EP 2.22系统在隔音屏蔽室进行双侧ABR阈值测试。刺激声音采用突发音调，带通滤波宽度为300 ~ 3 000 Hz，叠加次数为65438±0024次，扫描时间为65438±00ms。电极排列如下:颅顶为记录电极，耳为参比电极，接地极置于鼻尖。使用2 kHz、4 kHz、8 kHz和16 kHz的短纯音作为刺激音。
1.4样品制备
断头后取出颞骨，打开听泡，在耳蜗顶部钻一个小孔，同时打开卵圆窗和圆窗；然后用吸管将4%多聚甲醛固定液从耳蜗尖的小孔灌入耳蜗，直到液体从两个窗口流出，再将颞骨浸入固定液中固定。取实验组8只ABR阈值大于95 dB SPL的豚鼠耳蜗和对照组3只耳蜗进行常规冰冻切片，实验组14只ABR阈值大于95 dB SPL的豚鼠耳蜗和对照组3只耳蜗进行免疫荧光染色，取实验组4只ABR阈值大于95 dB SPL的豚鼠耳蜗和对照组2只豚鼠耳蜗制备扫描电镜样品。
1.5免疫组织化学染色
耳蜗标本用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次。0.1% Triton-PBS三分钟。10%羊血清(稀释在0.01% Triton-PBS中)在室温下密封30分钟，将羊血清密封液倒出，不洗涤。加入兔源性肌球蛋白抗体和鼠源性神经丝抗体(SIGMA Biotechnology Company)，用3%羊血清Triton-PBS稀释，4℃冷冻过夜。用0.1% Triton-PBS洗涤10分钟，每次三次。加入二抗(用荧光染料Alexa Flour 488标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG抗体)，室温避光孵育一小时。PBS洗10分钟各三次。防淬火密封片。通过激光扫描* * *聚焦显微镜(德国LSM蔡司510 Meta)观察。
1.6扫描电镜样品制备
耳蜗组织取出后，所有标本用戊二醛和四氧化锇固定，2%单宁酸染色，梯度乙醇脱水。乙酸异戊酯过量，用日立生产的HCP-2临界点干燥机和E-102真空离子溅射仪干燥样品，再用S-4800扫描电镜观察拍照。
2结出果实
2.1组织形态学观察
由于个体差异，豚鼠对药物的敏感性不同。25个实验组的13只豚鼠在用药1周后ABR阈值大于95 dB SPL。对这些重度聋豚鼠耳蜗的扫描电镜观察显示，第一、二回路内、外毛细胞的静纤毛散在融合，甚至全部毛细胞被瘢痕取代(图1)。聋豚鼠耳蜗切片光镜观察，耳蜗毛细胞受损严重，主要是外毛细胞。第一、二回路耳蜗毛细胞损伤较第三、四回路严重，部分豚鼠受损严重。内毛细胞也普遍缺失(图2)。
2.2免疫荧光组织学观察
对用药后不同时间点ABR阈值大于95 dB SPL的5只豚鼠(65，438±00耳)进行免疫荧光染色。在激光扫描* * *聚焦显微镜下发现，与正常对照组相比，除给药后65，438+0周的65，438+0豚鼠和给药后65，438+0周的65，438+0豚鼠双耳神经纤维几乎正常。与毛细胞的损伤类似，耳蜗第一、二回的神经纤维损伤比第三、四回更严重(图3)。
3讨论
氨基糖苷类抗生素的耳毒性与氧自由基的毒性作用密切相关[4]，袢利尿剂可引起血管纹中毒，损害分泌淋巴液的功能[2]。上述两种药物合用时，氨基糖苷类抗生素与内耳毛细胞膜接触，使内耳毛细胞通透性增加，而袢利尿剂高浓度进入细胞，对毛细胞造成损伤[5]。
1979 Russell等人[6]首先将KM和尿酸应用于豚鼠。Asakuma等人[7]研究了呋塞米和尿酸在有和没有硫酸卡那霉素的情况下对豚鼠耳蜗DC电位的影响。
Bobbin等[8]用高效液相色谱法(HPLC)研究了钾诱导豚鼠耳蜗γ-氨基丁酸(GABA)等物质的释放。豚鼠耳蜗灌注正常K+浓度(5 mmol/L)和高K+浓度(50 mmol/L)的人工外淋巴液，包括正常动物和预先用卡那霉素和尿酸损伤的Corti器。作用-氨基丁酸、2-氨基乙磺酸、谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸显著高于正常钾浓度组。与正常组相比，Corti器破坏组钾诱导的GABA、2-氨基乙磺酸、谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的释放明显减少。从结果分析，认为GABA的释放与其在耳蜗中的神经递质是一致的。
Raphael等人[9]研究了使用耳毒性药物后豚鼠耳蜗的结构和分子变化。发现耳蜗毛细胞的表皮层和静纤毛上的肌动蛋白丝消失，濒死毛细胞的顶部区域出现富含肌动蛋白的桥状结构。两个支持细胞在原毛细胞的位置形成疤痕，支持细胞扩张并侵入Nuel间隙和先前毛细胞所在的区域。疤痕区域可以用细胞角蛋白来标记。还发现最终变性的部位是毛细胞的顶端，毛细胞的变性与瘢痕形成同时发生。在本研究中，我们通过扫描电镜观察，还发现在严重损伤的豚鼠耳蜗中，感觉上皮区域完全被瘢痕所取代(图1)。
从我们前期的实验结果可以看出，KM和呋塞米联合用药引起的豚鼠耳聋是双侧对称性的，在1周的用药后，半数豚鼠会出现重度感音神经性耳聋[3]。对这些聋豚鼠耳蜗的病理学研究发现，耳蜗毛细胞受损严重，主要是外毛细胞，第一、二回路耳蜗毛细胞受损较第三、四回路严重。耳蜗神经纤维染色显示聋豚鼠的神经纤维明显减少，这也说明第一、二回路比第三、四回路减少更严重。探讨KM和呋塞米引起毛细胞损伤的机制，可能是外毛细胞吞食耳毒性药物的能力强于内毛细胞，基底回和顶回的外毛细胞摄取耳毒性药物的能力不同。至于为什么不同部位的毛细胞具有不同的药物摄取能力，推测可能与细胞膜上药物转运体的分布和活性有关[4]。
董敏生的实验证明，连续肌肉注射KM 6天后，内耳感觉细胞首先受损，支持细胞的变性明显晚于毛细胞，螺旋神经节和神经纤维的变性更晚，因此认为内耳感觉细胞受损是KM引起听力损害的根本原因。我们的实验结果与内耳感觉细胞的损伤是一致的，但我们发现KM和呋塞米合用后，不仅内耳的感觉上皮受到损伤，而且听神经纤维也受到损伤。
2004年Nourski等[1]报道了用KM和尿酸建立急性耳聋动物模型，并在急性豚鼠实验中观察了这种方法的效率，检测了听觉灵敏度和听神经状态。为此，重复检测了声诱发复合动作电位(ACAP)和电诱发复合动作电位(ECAP)。结果发现，6只豚鼠中有4只在尿酸给药后4 ~ 6小时内ACAP振幅降至零，而其余2只在给药后65，438±00小时内ACAP仍继续反应。同时，作者还记录了ECAP。与ACAP不同，ECAP的振幅在每次实验中相对恒定，并且证明没有与给药后的时间或ACAP的作用相一致的变化。基于ACAP和ECAP的结果，作者得出结论:KM和尿酸类药物对毛细胞功能有靶向性损伤，而没有明显抑制听神经反应性，这似乎与我们的一些实验结果相矛盾。造成这种差异的原因是用药后的观察时间不同:Nourski等人的观察时间是在用药后10小时内，而我们的观察是在用药后1周内，听神经纤维可能在用药后10小时内没有受损，但在1周神经纤维开始受损，用药3周后神经纤维明显受损。
参考
1 Nourski KV，Miller CA，Hu N，等。卡那霉素和依他酸联合给药作为急性动物实验的一种震耳欲聋的方法。听到决议，2004年，187(1-2):131-133。
2董民生、董明民、楼。内耳疾病的研究进展。郑州:河南医科大学出版社，1999: 12 -22。
3张喜安芬，师洋明，胡银燕，等。卡那霉素和速尿联合应用后豚鼠耳蜗听功能的研究。中国听力语言康复科学杂志，2008，6 (2): 15-20。
4丁大连，萨尔维。氨基糖苷类抗生素的耳毒性研究。中国耳科杂志，2007，5 (2): 125-131。
5张雅玫。药物性耳聋。中华儿科杂志，2000，38 (12): 781-782。
6新泽西州拉塞尔，福克斯柯，布鲁梅特RE。卡那霉素与依沙酸相互作用的耳毒性效应。耳蜗超微结构与耳蜗电位和卡那霉素水平相关。耳鼻喉学报，1979，88 (5-6): 369-381。
7浅间S，雪JB。呋塞米和依沙酸对正常和硫酸卡那霉素处理豚鼠耳蜗内直流电势的影响。O tolaryngol头颈外科，1980，88(2): 188-193。
8线轴RP，张敬利G，法伦m。钾诱导豚鼠耳蜗GABA和其他物质的释放。听到决议，1990，46(1-2): 83-93。
9拉斐尔Y，阿尔特舒勒岭。药物性耳蜗损伤后的瘢痕形成。听到Res，1991，51(2):173-183。