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高效液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮的残留量

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作者；姜伟、方小明、唐一锋、庞国芳

目的建立脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留量的测定方法。方法色谱柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm，5微米)；流动相:乙腈-水(65:35)；流速:1.0毫升/分钟；柱温:35℃；检测波长:292nm；结果样品的平均回收率为86.7% ~ 965438±0.8%，相对标准偏差为4.5% ~ 6.0%，样品的平均回收率为865438±0.4% ~ 95.0%，相对标准偏差为3.7% ~ 7.65438±0%。结论该方法简便、准确，可用于脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留量的测定。

高效液相色谱法；脂肪；醋酸甲羟孕酮；醋酸甲地孕酮；氯地孕酮

高效液相色谱法测定牛肉和猪肉脂肪中的孕激素

摘要目的建立牛肉和猪肉脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的测定方法。方法色谱柱为c 18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水(65:35)。流速为65438±0.0毫升/分钟；柱温为35℃；检测波长为292nm结果实验室内平均回收率为86.7% ~ 965438±0.8%，相对标准偏差为4.5%~6.0%。实验室间加标回收率为865438±0.4% ~ 95.0%，相对标准偏差为3.7% ~ 7.65438±0%。最低定量限(LOQ)为10微克/千克。结论该方法简便、灵敏。适用于牛肉和猪肉脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的测定。

关键词高效液相色谱；脂肪；醋酸美仑孕酮；醋酸氯地孕酮；醋酸甲地孕酮

醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮为合成促孕药，具有明显的促孕和抗雄激素作用，并能抑制排卵。孕酮对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用。动物实验表明，有增加死胎率和致畸作用，副作用为:(1)恶心、头晕、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用会增加女性后代的阳刚之气。孕酮类药物能增强体内物质的沉积，提高生产性能，能迅速产生显著而直接的经济效益，因此对生产者极具吸引力。孕酮类药物(非治疗性使用)在畜牧业中的使用由来已久，但人类长期食用含激素的肉类食品，即使含量很少，也会明显影响体内激素平衡，存在致癌风险，造成儿童发育异常等危害。因此，有必要开发一种能够检测孕酮残留的方法。

检测孕激素的方法有很多，比如液相色谱/质谱(LC/MS) [1]、气相色谱/质谱(GC/MS) [2，3]和液相色谱[4-6]。本文采用高效液相色谱法检测牛和猪脂肪中的孕酮。

1试剂和仪器

1.1试剂:醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮(Sigama公司)、乙腈(HPLC级)、甲醇(HPLC级)、乙酸乙酯(HPLC级)等试剂标准品为分析纯。水由Milli-Q净化系统(Millipore公司)制造。

(1)标准储备溶液:1000微克/毫升。准确称取0.050g醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮于50ml容量瓶中，用甲醇定容。在4℃下储存，可使用一年。

(2)混合中间溶液I: 100μ g/ml，分别吸取100ml醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于100ml容量瓶中，用甲醇定容。在4℃下储存，可使用一年。

(3)混合中间体溶液II: 1.0μ g/ml，将1.00ml混合中间体溶液I置于100ml容量瓶中，用甲醇定容。可在4℃保存半年。

(4)混合标准工作溶液:分别吸取10、20、40、80、100μl混合中间溶液II，加入到980、970、950、910、890μl乙腈-水(65:35)中，然后加入。得到浓度为0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml和0.10μg/ml的混合标准工作液，供当天液相色谱测定使用。

1.2仪器沃特世液相色谱系统，510泵体，486紫外-可见光检测器，Emprower pro色谱软件。氮气吹干机(Organomation Associates，Jnc。);固相萃取单元(su pelco)；低温离心机(德国Eppendorf)；涡流混合器(XW-80A，上海医科大学仪器厂)；CN固相萃取柱(3ml，沃特世公司)。

2个测定步骤

2.1样品制备和保存

2.1.1样品的制备将约5g猪或牛的脂肪组织切成小块，然后放入底部有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的烧杯中，将烧杯放入微波炉中。根据煮出的脂肪量，用最大功率加热30 ~ 60s。如果脂肪没有融化，间隔30 ~ 60s后反复加热30 ~ 60s，直到液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中。将煮沸的脂肪油放入样品瓶中，密封并做好标记。

2.1.2样品的保存将煮沸的脂肪油样品置于-18℃冷冻。

2.2提取并称量煮沸的脂肪油2.00±0.01g，置于带塞的50ml离心管中，加入5ml乙腈，在60℃水浴中保温3min，使固体脂肪融化，涡旋振荡1min，在-5℃离心7min(离心力1160g)。向合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，涡旋振荡65438±0分钟，在-5℃离心5min(离心力为1160g)，弃去正己烷层。乙腈提取液用氮气干燥器在60℃干燥，残渣皂化。

2.3皂化:向残渣(2.2项)中依次加入4ml正己烷、1ml 0.1mol/L氢氧化钠溶液和0.5ml 1.0mol/L氯化镁溶液，在涡旋混合器上混合均匀10s，在60℃水浴中保温155min。向沉淀物中加入4ml正己烷，混匀，60℃水浴加热15分钟，在-5℃离心5分钟(离心力1160g)，合并上清液。用氮气吹干机在60℃吹干，用1.0ml正己烷溶解残渣，进行净化。

2.4纯化将皂化样品溶液(2.3项)倒入用5ml乙酸乙酯和6ml正己烷预处理的CN柱中，用2×1ml正己烷润湿玻璃管，将洗液倒入CN柱中。样品液流通过后，依次用5ml正己烷和6 ml含5%乙酸乙酯的正己烷溶液冲洗小柱，然后开启真空泵，排出小柱中的液体，并保持抽吸2分钟。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，洗脱液收集在15ml玻璃试管中，用氮气吹干机在60℃下吹干。残留物用990μl乙腈-水(65:35)涡旋溶解，静置65438±05分钟后，加入65438±00μl 0.2%盐酸溶液，混匀，用液相色谱法测定。

2.5决心

2.5.1 HPLC条件:Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5微米)；预柱:C18柱(12.5mm×4.6mm，5微米)；流动相:乙腈-水(65:35)；流速:1.0毫升/分钟；柱温:35℃；检测波长:292nm；样品体积:40微升

2.5.2液相色谱法测定根据样品溶液中三种孕酮的含量，选择浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样品溶液中三种孕酮的响应值应在仪器检测的线性范围内。将标准工作溶液和样品溶液插入样品中进行测定。标准品在上述色谱条件下的色谱图见图1。

图1醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮(100ng/ml)的色谱图1-醋酸甲地孕酮、2-醋酸氯地孕酮、3-醋酸甲地孕酮

高效液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量。

3结果和讨论

3.1线性范围醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的浓度范围为0.010 ~ 0.10μ g/ml，峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数(γ2)均大于0.998。

3.2回收率、精密度和定量检测限本实验以两种脂肪(牛脂肪和猪脂肪)为样品。向2.0g样品中加入适量标准品，使加入量相当于10、20和50μg/kg，每个加入水平取24个样品(每种脂肪取12个样品)。图2是空白脂肪样品和添加样品(10μg/kg)的色谱图。表1显示了用醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的外标法测定的室内回收率和准确度。表2显示了8个实验室的室间回收率和准确度的结果。根据回收率试验，可以可靠测定的最低浓度可以确定定量检出限(LOQ)，为10μg/kg，符合残留限量的检测要求。

(一)

(二)

(三)

(四)

图2空白脂肪样品和添加样品(10g/kg)的色谱图A:牛脂肪空白样品；b:猪脂肪空白样品；c:牛肉脂肪添加样品；d:猪脂肪添加样品

表1室内回收率和准确度结果(每次添加n=24)

表2 8个实验室的实验室间回收率和准确度结果(每次添加n=32)

参考

1胡伊杰林克H，范本内科姆EO，尼伦MWF。使用加速溶剂萃取和液相色谱-电喷雾串联质谱法筛选肾脂肪中的促孕激素。肛门化学学报，2003，483(1-2): 51-59。

2 Neidert EE，Gedir RG，Milward LJ，等.用电子捕获气相色谱法和气相色谱化学电离质谱法测定和定性确认牛肉脂肪中的醋酸美仑孕酮残留量.农业食品化学杂志，1990，38(4): 979-981。

3 Impens S，Courtheyn D，de Wasch K，等。通过缩减样品尺寸和使用气相色谱-串联质谱法更快地分析肾脂肪中的合成代谢类固醇。肛门化学学报，2003，483(1-2): 269-280。

4 Gaver RC，Movahhed HS，Farmen RH，等。人血浆中醋酸甲地孕酮的液相色谱定量分析方法。药学科学杂志，1985，74(6): 664-667。

5奥弗迪克JWPM，赫尔曼斯·瓦伊，默库斯JWPM。高效液相色谱法测定螺内酯及其代谢物的血清浓度。J Chromatogr B，1985，42(2): 279-285。

6 Campbell HM，Sauve F .液相色谱法测定饲料中的醋酸美仑孕酮。AOAC国际机场，1993，76(6):1163-1167。

液相色谱法测定猪和牛脂肪中的黄体酮残留来自:思想报道网

参考资料: