药学毕业论文开题报告(二)

药学毕业论文开题报告3

标题:番泻叶对小鼠尿量的影响

研究现状:

首先，支链淀粉酶

支链淀粉酶(EC.3. 2。1.41)是一种能特异性切割支链淀粉分支点的酶。-1.6糖苷键，从而切断整个侧枝，形成直链淀粉脱支酶。普鲁兰酶也能分解普鲁兰。普鲁兰酶来源于微生物，而R-酶来源于植物。普鲁兰酶最早是由Bender和Wallenfels在1961中通过产气杆菌(克雷伯氏菌属肺炎杆菌为典型细菌)获得的，他们报道了这种酶良好的酶学性质。之后，各国研究者经过广泛深入的研究，从不同地域和微生物中获得了普鲁兰酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。

在淀粉加工工业中，淀粉酶是最常用的，它的作用是水解淀粉？-1，4糖苷键，单独使用时，产品中含有大量支链糊精，包括大量？-1，6糖苷键。如果不放淀粉？如果-1，6的糖苷键完全分解，必然造成极大的浪费。自然界中，还有能分解淀粉的？-1，6糖苷键酶，俗称脱支酶。丧偶？-1，6葡萄糖苷酶(e.c3.2.1.68，oligo-l，6-葡萄糖苷酶)、普鲁兰酶(e.c3.2.1.41普鲁兰酶)、异淀粉酶(e .支链淀粉-6-葡聚糖酶(e.c3.2.1.69，支链淀粉-6-葡聚糖酶)，其中普鲁兰酶对底物分子结构要求最小，所以可以所以很多国家都在争相开发，但到目前为止，只有丹麦的NOVO公司具备普鲁兰酶的生产能力。我国仅进口，但其高昂的价格限制了普鲁兰酶在我国的应用。事实上，我国早在20世纪70年代就开发了一种普鲁兰酶产生菌，但其酶学性质不适合生产，至今国内尚无普鲁兰酶国产化的报道。

在淀粉加工行业，要求普鲁兰酶的酶学性质是耐酸耐热的，因为通常采用的是外酶法。由于所用酶的限制，普鲁兰酶可以在两步反应的任一步中加入，但必须满足上述反应条件。因此，普鲁兰酶的酶学性质必须满足酶水解制糖的现有条件，即耐酸性和耐热性。

二、普鲁兰酶的研究现状

1.产支链淀粉酶的微生物

普鲁兰酶最早由Bender和Wallenfels在1961年由Aerobacter产生。

产气)是通过发酵获得的。在他们报道了该酶的良好性能后，各国研究者经过广泛深入的研究，从不同地区的微生物中获得了该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但到目前为止，虽然已经发现很多微生物都可以产生普鲁兰酶，但是由于目前工业生产条件(酸度和温度)的限制，大多数微生物产生的普鲁兰酶都没有商业价值。下面简单介绍一下普鲁兰酶产生菌。

1.1蜡状芽孢杆菌真菌变种

是日本的ToshiyukiTakasaki在1975年发现的。该菌株同时产生两种淀粉酶:？-淀粉酶和支链淀粉酶。最适反应条件为pH 6 ~ 6.5，温度50℃，最大转化率(淀粉水解生成麦芽糖)约为95%。酶学研究表明，该酶在pH5和60℃下仍保持大部分活性，该菌株营养细胞呈杆状，聚集并生长成短而不等的无序链，不动，革兰氏阳性，出芽时细胞无明显扩张。该菌株最适生长温度为30℃ ~ 37℃，最高生长温度为41℃ ~ 45℃。可以使用葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、海藻糖、淀粉和糖原。

1.2嗜酸普鲁兰分解芽孢杆菌普鲁兰。

80年代初，丹麦Novo公司获得了该菌株，该菌株产的普鲁兰酶耐热。

(60℃)，耐酸性(pH4.5)。该公司在研发方面投入巨资，1983 11月。该公司在日本和欧洲市场以商品名Prornozyme进行商业销售。如今，它是应用最广泛、产量最大的普鲁兰酶。芽孢杆菌。解酸乳杆菌呈杆状。经过几个小时的深层发酵，可以观察到原生质体样细胞的膨大细胞，细胞比较稳定，充满圆柱体或椭球体。革兰氏反应呈阳性，在37℃生长良好，45℃以上不长，pI-1在6.5以上，在以普鲁兰为碳源的培养基(pH4.8 ~5.2)上生长良好。

1.3枯草芽孢杆菌

在1986中，日本Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌株，命名为枯草芽孢杆菌TU。该菌株产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽三糖，水解的普鲁兰酶为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最适pH为7.0 ~ 7.5，但在pH5.0时也有50%左右的酶活，该普鲁兰酶最适温度为60℃。

1.4耐热氯磺隆

1987.德国的E.madi报道了一种能同时产生α-淀粉酶、普鲁兰酶和糖化酶的菌株:耐热梭菌和产硫菌。该菌株产生的普鲁兰酶具有较宽的温度适应范围(40℃ ~ 85℃)，在pH 4.5 ~ 6.0具有较高的活性。无疑将拓展这种普鲁兰酶的应用领域。

1.5 naganoensis杆菌，deramificans杆菌，芽孢杆菌。酸支链淀粉

在20世纪90年代，Deweer发现了一种产普鲁兰酶的芽孢杆菌。富村筛选出了结核杆菌。这两种菌株产生的普鲁兰酶的酶学性质与芽孢杆菌相似。这两个菌株是中度嗜酸的，不会在pH6.5以上生长，也不会在45℃以上生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现进一步拓宽了普鲁兰酶的应用范围。

1.6产普鲁兰酶的嗜热细菌

20世纪80年代以来，人们逐渐意识到在正常的自然条件下很难筛选出极端耐热的普鲁兰酶产生菌，于是各国科学家都把目光投向了温泉嗜热菌的筛选，现在已经取得了更多的成果。vorcaldarius等芽孢杆菌产生普鲁兰酶的最适温度为75 ~ 85℃，最适pH为6.3。海洋嗜热栖热菌的最适温度和最适pH值分别为90℃和6.0，嗜热栖热菌的最适温度和最适pH值分别为75℃和5.5，保那沃氏杀藻的最适温度和最适pH值分别为80 ~ 85℃和6.0。

2.普鲁兰酶的分子结构

到目前为止，已经克隆了许多普鲁兰酶的基因，但是还没有关于普鲁兰酶结构的报道。然而，根据基于序列相似性的糖键水解酶的分类，支链淀粉酶属于13家族。淀粉酶家族包含30多种酶，可分为水解酶和转移酶。异构酶分为三类。这些酶可以水解和合成？~1.4,?~1.6,?~1.2,?~1.3,?~1.5,?~ 1.1糖苷键。许多这类酶的结构已被报道，它们都采用了(？/?)8、通过生物信息学研究，该家族所有的蛋白质都具有相同的结构，酶的活性中心是(？/?)8折叠管的结构被命名为畴A..13家族中的大多数酶也有结构域B，它位于(？/?)折叠管里8个，第三个？层状和第三种？螺旋之间的序列具有结构和长度差异大的特点，推测其功能与底物的结合有关。紧接着(？/?)8折管后还是c域，其次是c域，部分家族成员也有d域。

3.普鲁兰酶的应用

普鲁兰酶是食品工业中广泛使用的酶制剂和加工助剂。它能特异性分解淀粉及其衍生的低聚糖分支中的支链淀粉和糖原分子。~ l，6糖苷键打破分支结构，形成不同长度的直链淀粉。因此，当这种酶与其他淀粉酶结合使用时，淀粉可以完全糖化。近年来，普鲁兰酶作为一种新型淀粉酶，已应用于以淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中具有以下功能:

3.1单独使用支链淀粉酶将支链淀粉转变为直链淀粉。

直链淀粉具有凝结和易形成结构稳定的凝胶的特性，可用作韧性食品包装膜。这种膜适合作为食品的保护层，因为它对氧和油脂具有良好的隔离，并且具有良好的涂覆性能。也适用于淀粉软糖的制造，也可作为果酱增稠剂，用于高含油量食品的灌装，防止漏油，肉类食品加工。近年来，生物降解膜在食品工业中得到提倡，直链淀粉在这些方面有很大的发展前景。豆类的直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性优于其他淀粉。如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，然后制成直链淀粉，就可以制成高品质的粉丝。在一般的谷物淀粉中，直链淀粉含量只占20%，支链淀粉含量在80%左右。工业上每生产1吨直链淀粉，就有4吨副产品支链淀粉。虽然美国通过遗传育种获得了含60%直链淀粉的玉米新品种，但不适合大规模生产。普鲁兰酶在国外已被用于改变淀粉结构，可将支链淀粉转变为直链淀粉。据报道，用这种方法产率可达100%。直链淀粉的制作方法是:先用普鲁兰酶分解液化的树枝使其转化为直链淀粉，再用丁醇或缓冷沉淀淀粉。然后回收含有少量水的结晶沉淀，最后通过低温喷雾干燥制得粉状直链淀粉。

3.2普鲁兰酶和？~ (13)淀粉酶生产麦芽浆

麦芽糖是我国传统的淀粉糖产品，含有一定量的麦芽糖，广泛应用于糖果、糕点等食品行业。现在的制作方法是什么？~淀粉酶液化再利用？~淀粉酶水解支链淀粉，只能水解侧链。接近十字位置？当糖苷键为~ 1.6时，水解反应停止。但如果用普鲁兰酶进行同步水解，可以使支链断裂，提高淀粉酶的水解度，降低淀粉酶的水解度。极限糊精的含量大大提高了麦芽糖的得率，有利于麦芽糖浆的生产。目前，普鲁兰酶糖化已经进行了大规模实验。

测试条件如下。每批投料量约900kg碎米，浆液浓度15 ~ 16be？计皮剂量为1.5%(碎米用)。~ (13)淀粉酶活性大于2000单位/克，pH5.8普鲁兰酶活性为45000 ~ 55000单位/克，由产气单胞菌产生，每批用量为1公斤。结果表明，与对照糖相比，还原糖增加65438±04.8，麦芽糖含量增加45.6，糊精含量减少26.7。与高浓度葡萄浆相比，高浓度麦芽糖浆具有不易结晶、吸湿性低的特点，因此被广泛应用于食品工业。普鲁兰酶和β-淀粉酶的组合成本低，麦芽糖得率达到70%左右，甚至更高。

3.3用于酶法啤酒糖化。

啤酒生产中的麦芽不仅是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。啤酒酿造的糖化过程中，分解麦芽中淀粉的主要酶有哪些？~淀粉酶，？~淀粉酶和分解淀粉？~ 1.6 R-酶(植物普鲁兰酶或植物普鲁兰酶)。？~ (2+)淀粉酶通过与另外两种淀粉酶的协同作用，将淀粉分解为麦芽糖(包括少量麦芽三糖和极少量葡萄糖)和低分子糊精。从而使麦芽汁具有理想的糖成分。工业生产中为了节省麦芽用量，采用所谓的额外酶解糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉辅助原料的配比，并添加适当种类的酶制剂进行搪瓷。为了将大麦等辅料完全糖化，需要加入α-淀粉酶进行分解？~ 1.6糖苷键普鲁兰酶制剂等。当单独使用α-淀粉酶时，产生麦芽糖和麦芽三层是不完全的。淀粉被分解了怎么办？如果~ 1.6糖苷键的酶活不足，淀粉分解不彻底，导致可发酵糖含量低，啤酒的发酵度达不到要求。如果可以分解？~ 1.4和？糖苷键为~ 1.6的糖化淀粉酶的反应产物是葡萄糖，容易使酒的味道变淡。使用普鲁兰酶和？~ (13)淀粉酶效果较好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。用外加酶法糖化时，酶制剂的用量为:淀粉酶6-7单位/克大麦和大米:蛋白酶60-80单位/克，并添加菠萝蛋白酶10ppm和普鲁兰酶50单位/克大麦。上述三种酶制剂在糖化或醇化开始时添加。

总之，普鲁兰酶作为酶制剂和加工助剂在食品工业中具有广阔的发展前景。

研究目的和意义:

酶制剂工业是20世纪70年代以来形成的一个重要产业。目前世界酶制剂总产值为6543.8+000亿美元，我国产值约为6543.8+000亿元人民币。随着其应用领域的不断扩大和新酶种的开发，这一市场发展迅速。然而，全球酶制剂行业几乎被几家外国公司垄断，其中丹麦的诺华几乎占全球总销售额的一半。该研究对普鲁兰酶的开发和酶制剂工业的发展具有重要意义。

其次，我国从20世纪70年代开始研究开发普鲁兰酶，但开发的普鲁兰酶既不耐热也不耐酸，限制了其工业应用。为了改变我国对进口产品的依赖，填补这一领域的空白，找到一条本土化的道路，本研究的目的是利用天然微生物资源——普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工业的生产率，这对我国淀粉加工业的意义不言而喻。

研究内容(内容、结构框架、重点难点):

1.普鲁兰酶产生菌的筛选

(1)样本采集；

(2)菌株的初步筛选；

(3)菌株复筛；

(4)菌种的保存方法；

(5)酶活性测定方法的建立。

2.普鲁兰酶产生条件的研究。

(1)碳源和氮源对发酵产酶的影响:

(2)初始PH对产酶的影响；

(3)接种量对产酶的影响；

(4)发酵温度对产酶的影响；

(5)金属离子对产酶的影响。

关键点或关键技术:

(1)纯菌株的分离；

(2)菌株鉴定方法的选择。

研究方法和手段:

1.普鲁兰酶产生菌的筛选

(1)样本采集:选择合适的地点(面粉厂、菜地、果园等。)采集土壤样本。

(2)菌种初筛:将采集的土样用无菌水稀释后，涂于含淀粉培养基中的平板上，37℃培养48h后，与碘溶液显色反应，将含淀粉酶的菌落接种于斜面上保存。

(3)菌株的复筛:将前期分离的产淀粉酶菌株涂于普鲁兰平板上，37℃培养48h，然后用95%乙醇进行透明圈实验。透明圈的产生表明该菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑在斜面培养基上培养。

(4)菌种保藏法:4℃低温保藏。

(5)酶活测定方法的建立:将发酵液离心，在520nm处用DNS显色法测定吸光度，并测定葡萄糖的标准曲线，由标准曲线计算普鲁兰酶的活性。

2.普鲁兰酶产生条件的研究。

(1)碳源和氮源对发酵产酶的影响:用不同的碳源和氮源培养一段时间，测定酶活力。其他条件相同:接种量、装瓶量、初始PH值、转速、培养时间。)

(2)初始pH对产酶的影响:使用相同的发酵培养基，在不同的初始PH下接种相同量的种子液..在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。其他条件相同:接种量、装瓶量、转速、最佳培养温度、最佳培养时间。)

(3)接种量对产酶的影响:分别以2%，4%，6%，8%的接种量接种到发酵培养基中，

将10%、14%和18%的种子培养液在相同条件下培养于最佳碳源、氮源和最佳初始PH的培养基中，分别检测酶活性。(采用上面确定的最佳碳源、氮源和最佳初始PH。)

(4)发酵温度对产酶的影响:使用同一种培养基，在不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)下培养一定时间，测定酶活力。

(5)金属离子对产酶的影响:在基础培养基中添加少量不同的金属离子，发酵后测定酶活力。(金属离子包括:锰离子、钙离子、锌离子、镁离子、铁离子、铜离子。)

研究进展

:完成项目总体进度的30%，样品土壤样品的采集和前期准备，菌种的初步筛选，包括(样品土壤原液的涂布培养和摇床培养，产普鲁兰酶菌种的选择和斜面培养)。

项目总体进度的50%，菌种复筛，包括(普鲁兰酶产生菌的筛选和斜面培养)，葡萄糖标准曲线的测定，酶活测定方法的建立，根据酶活进行菌种复筛。

:完成项目总体进度的80%，研究产酶条件。包括碳源、氮源、初始PH值、接种量、发酵温度和金属离子。通过单因素实验确定了发酵培养基的最佳碳源、氮源、初始PH值、接种量、发酵温度和金属离子。

2009、4?09年5月:项目整体进度100%，项目总结，论文撰写。

文献综述(包括:国内外研究理论、研究方法、进展、存在问题、参考依据等。)

普鲁兰酶是在1961年Bender H .等人研究一种产气杆菌(克雷伯氏肺炎杆菌是典型的细菌)时首次发现的。经过对产生这种酶的微生物的大量研究，发现许多微生物都能产生这种酶，并筛选出一些适合工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用和发展，耐热普鲁兰酶的研究逐渐增多，该酶的基因已被成功克隆和表达。一株产气杆菌10016的普鲁兰酶在中国从65438到0976进行了研究。报道了该酶的生产条件、分离提取及其酶学性质，并对该酶的食品级提取工艺进行了研究。另外，陈、等从云南热泉水样中筛选出一株产普鲁兰酶的嗜热菌株。通过诱导等实验，酶活从0.069u/mL提高到1.70 U/mL，酶产量提高了约2500倍。该酶最适温度为75℃，最适pH为4.5，具有一定的耐热性和耐酸性。

陈金泉等人从温泉水样中筛选出一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株。根据形态特征、生理生化特征、细胞化学组成分析、16SrDNA序列比较、基因组DNA G+C摩尔百分比、同源性比较等实验，鉴定为脂环酸芽孢杆菌新种，产酶最适温度为60℃。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了高表达普鲁兰酶的基因工程菌株。在最佳发酵条件下，摇瓶发酵普鲁兰酶活可达350.8U/mL，产量可达504.5-510.1U/mL。该酶的最适温度为60 ℃,最适pH为4.5，具有良好的耐热性和耐酸性。目前国内还没有能够独立生产普鲁兰酶的厂家，要实现低成本、本地化生产还有很长的路要走。

技术在耐热脱支酶研究中的应用，使耐热异淀粉酶的研究取得了很大进展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii的普鲁兰酶基因克隆到枯草芽孢杆菌中，克隆分泌的普鲁兰酶量高于原始菌株。Okada等人将编码嗜热脂肪芽孢杆菌耐热异淀粉酶的基因克隆到枯草芽孢杆菌中，得到的转化菌株的异淀粉酶在60℃下稳定15分钟。Burchadf会的。克隆并在大肠杆菌中表达了38%的嗜热异淀粉酶基因，获得的酶的最适pH和温度与出发菌株相同，在高温下仍能保持活性。Antranikiam等人将来自Pyrococcus riousous的异淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中，并分离出该酶蛋白。尽管如此，还没有转基因耐热异淀粉酶工程菌应用于工业生产的报道。众所周知，用物理和化学诱变剂单独或联合处理微生物细胞是选育高产突变菌株的有效经典方法。它在培育各种抗生素、氨基酸和核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产突变菌株中发挥了极其重要的作用，至今仍是方便有效的方法之一。

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