求绿色荧光蛋白研究的毕业论文。
GFP标记HepG2细胞总RNA转染树突状细胞的体外效应
摘要目的:探讨绿色荧光蛋白作为标记物观察肿瘤细胞总RNA转染的树突状细胞的可行性，以及转染的树突状细胞作为潜在免疫治疗疫苗的可行性。方法:将质粒pGFPC3稳定转染入HepG2细胞。使用Trizol从HepG2GFP提取总RNA肝癌患者外周血单个核细胞(PBMCs)诱导树突状细胞，并转染总RNA。荧光显微镜观察转染效果，流式细胞仪检测表型变化，ELISA法检测树突状细胞上清液中IL12分泌的变化。MTT法检测CTLs的细胞毒效应。结果:GFP在HepG2GFP细胞中稳定表达，荧光显微镜下呈绿色荧光，转染HepG2GFP细胞总RNA的树突状细胞也稳定表达。转染后，CD80 (13.2%至86.7%)、HLADR (38.9%至97.9%)、CD83 (0.9%至97.1%)、CD86 (31.2%至92.5%)等膜分子的表达量显著增加，上清中IL12的分泌量显著增加〔61.3±8.10000001转染总HepG2GFP RNA的树突状细胞激活的CTLs对HepG2细胞显示出有效的特异性裂解作用。结论:GFP可作为观察肿瘤细胞总RNA转染树突状细胞效果的标志。肿瘤细胞总RNA转染的树突状细胞可作为一种有前途的免疫治疗疫苗。
树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA转染
目的:探讨以绿色荧光蛋白(GFP)为标记观察肝癌(HCC) RNA转染树突状细胞(DCs)效果的可行性，以及将肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性。方法:绿色荧光蛋白颗粒载体PGPFPC 3稳定转染HCC HepG2，Trizol法提取HepG2GFP总RNA。肝癌患者外周血单个核细胞体外诱导树突状细胞，总RNA转染树突状细胞。荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后树突状细胞的表型变化。ELISA法检测转染前后上清液中IL12的变化。MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。结果:PGPFPC 3稳定转染HepG2细胞后，可获得稳定表达GFP的HepG2细胞，荧光显微镜下显示绿色荧光。在DCs荧光显微镜下，总RNA转染细胞显示绿色荧光，CD80(13.2%上升至86.7%)、HLADR(38.9%上升至97.9%)、CD83(0.9%上升至97.1%)和CD86 (31.2)。诱导的CTL能特异性杀伤HepG2细胞。结论:GFP可作为肿瘤细胞RNA转染的树突状细胞的观察标志，肿瘤细胞RNA转染的树突状细胞可作为有效的肿瘤疫苗。
树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA转染
中文图号R739.41
0简介
肝细胞癌，HCC)是一种常见的恶性肿瘤，只有少部分患者适合手术治疗，复发率高，预后差，严重威胁人类健康[1]。DCS(树突状细胞)是机体内功能强大的专业抗原提呈细胞。它可以有效地摄取和加工抗原，并将加工后的多肽呈递到静止的T细胞，引起针对抗原的特异性免疫反应[2]。在国内外的类似研究中，没有明确的指标来观察肿瘤RNA转染树突状细胞的效果。我们用绿色荧光蛋白颗粒载体pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选的HepG2GFP总RNA转染树突状细胞。观察绿色荧光蛋白、特异性表面标志和功能相关分子在转染的树突状细胞中的表达，并检测其上清液中细胞因子的分泌，以探讨其作为肿瘤疫苗的可行性。
1材料和方法
1.1材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者。HepG2肝癌细胞系由我科常规传代培养。流式细胞仪(BD)、DG3022A酶联免疫吸附测定(华东电子管厂)、XIF光学荧光显微镜(Nicon)都在我院常备。FITCCD80、FITCHLADR、PECD83和PECD86的抗体购自BD公司。RhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体PGPFPC 3由陕西省肿瘤医院贾军医生捐赠。脂质体转染2000，来自Invitrogen的Trizol试剂；；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker公司；。IL12 ELISA试剂盒购自Bioscience Company。MTT购自适马公司。
1.2方法按转染说明书2000，PGPFPC 3转染HepG2，G418筛选2个月。筛选出的细胞命名为HepG2 FP，在荧光显微镜下观察。用Trizol试剂提取HepG2 FP总RNA，在紫外灯下观察。在-80℃低温保存以备后用。用同样的方法提取HepG2总RNA。采用贴壁法分离肝癌患者的造血干细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF和rhIL4的作用下诱导为DCs。倒置显微镜和电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型。
1.2.1转染树突状细胞，收集培养4天的树突状细胞，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA，设立空白对照组。培养48小时。荧光显微镜下观察。
1.2.2细胞因子分泌的测定48小时后，收集各组DCs的上清液，用ELISA检测转染前后各组上清液中IL12的分泌情况。
收集各组65438±0 . 2 . 3 CTL效应树突状细胞。经30 Gy 60Co照射后，与复苏后的非贴壁细胞以20∶1的比例混合，接种于24孔板。培养5天后，收集的细胞是效应细胞。收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞。将效应细胞和靶细胞以20∶1的比例接种于96孔板中。同时设置单个目标细胞组和单个效应细胞组。培养24 h后，用MTT法检测。根据下式计算CTL的杀伤效率:[1-(有效靶A490-有效细胞A490)/靶细胞A490 ]× 65438。
统计学方法:用SPSS 10.0统计软件对结果进行分析。
2个结果
2.1 HepG2 FP总RNA转染入树突状细胞，稳定转染并筛选出能稳定表达GFP的HepG2 FP细胞。所有细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光(图1 ),并且在超过20次传代后保持不变。与对照细胞相比，GFP基因修饰的细胞在形态、生长等方面没有明显变化。GFP表达对靶细胞没有毒性。用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s、18 s和28 s的条带(图2)。单核细胞贴壁后，在细胞因子GMCSF和IL-4的作用下，培养第2天出现细胞集落，但5天后集落明显增多，变大，出现有毛刺样突起的细胞。在第7天，集落开始减少，导致大量具有树突突起的细胞(图3A，B)。在荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组的细胞显示绿色荧光，而HepG2总RNA转染组和空白对照组的细胞没有显示明显的荧光表达(图4A，B，C)。
图1荧光显微镜稳定转染PGPFPC 3后HepG2的细胞质荧光阳性×250(略)。
图2 2 hepg 2 GFP细胞总RNA电泳图(略)
图3树突细胞形态(第7天)(略)
2.2流式细胞仪显示细胞表型诱导d 7，DC中CD80 13.2%表达，H LADR 38.9%，CD86 31.2%，CD83低表达仅为0.9%。转染后，上述分子的表达显著增加，分别为CD80 86.7%、HLADR 97.9%、CD86 92.5%和CD83 97.1%，提示转染细胞具有成熟树突状细胞的特征。
图4转染入DCs×250的总RNA(略)
2.3ELISA法检测IL12分泌的HepG2GFP总RNA。
DCs转染组上清中IL12分泌明显增加，较转染前明显升高[(287.4±29.3)ng/l vs(61.3±8.1)ng/l；n=6，P < 0.05。
2.4CTL介导HepG2GFP总RNA的细胞毒性。DCs刺激的CTL对HepG2细胞的细胞毒作用为(62.6±2.9)%，未转染DCs刺激的T细胞为(20.8±65438±0.5)%，未被DCs刺激的T细胞为(20.8±65438±0.5)%。总RNA转染的DC刺激的CTL对HepG2细胞的细胞毒作用明显高于两个对照组(n=6，P < 0.05)，总RNA转染的DC刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞的细胞毒作用分别为(37.7±65438±0.8)%和(26.8±65438±0.62)。
3讨论
DCs是体内最强大的专职抗原提呈细胞，在T细胞免疫中起着极其重要的作用[2]。用各种肿瘤抗原致敏树突状细胞制备疫苗是近年来的研究热点[3-8]。与其他方法相比，转染DCs的肿瘤细胞总RNA具有以下优点:一是不受已知肿瘤抗原限制，可诱导多克隆CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增获得，少量的肿瘤组织样本可以通过扩增获得大量的RNA [8]。但是，目前国内外还没有明确观察总RNA转染树突状细胞效率的方法。我们用HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标志观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌的临床治疗提供实验依据。
本实验中，转染HepG2GFP RNA的DC胞质在荧光显微镜下呈现绿色荧光，证实了GFP mRNA可以在DC胞质中正常表达，肿瘤细胞总RNA也可以在DC胞质中翻译表达。转染后，CD83、CD80、CD86和HLADR的表达显著增加，IL12的分泌显著增加。结果表明，RNA转染促进了树突状细胞的体外成熟。成熟树突状细胞将肿瘤细胞总RNA翻译并表达的肿瘤抗原提呈给T淋巴细胞。该途径诱导的T淋巴细胞主要是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在本实验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒作用明显高于对照T淋巴细胞。证明诱导的T淋巴细胞具有肿瘤特异性。因此，在目前尚未发现肝癌特异性抗原的情况下，将肝癌细胞总RNA转染到DCs中制备肿瘤疫苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以成为肝癌DCs疫苗的一个发展方向。
参考
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