【代谢组学】现代仪器分析技术——代谢组学的技术基础和原理
主要内容:
1.?仪器分析技术的概念和类型
2.?代谢组学中的仪器分析方法
a)光谱分析b)色谱分析
3.?分析仪器组合技术(GC-MS,LC-MS,...)
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1.仪器分析技术的概念和类型
1.1什么是仪器分析技术
现代仪器分析技术:?利用相对复杂或专用的仪器设备,通过测量物质的物理或物理化学性质的参数及其变化,获得物质的化学成分、组成含量和化学结构等信息的方法。
1.2?仪器分析技术的分类
光谱分析:紫外-可见光谱(UV)、核磁共振光谱(NMR)、质谱(MS )……...
B.色谱分析:液相色谱,气相色谱...
C.物相分析:磁选分析、比重分析、X射线结构分析...?
元素分析:电子显微镜能谱分析(EDS),电感耦合等离子体质谱(ICP-ms)...
2.?代谢组学中的仪器分析方法
一、频谱分析法
原理:光的波粒二象性。
光和物质的相互作用:
?分子能级:分子处于特定的状态,具有一定的能量;?
分子能级跃迁:分子吸收能从低能级向高能级的跃迁;
?分子光谱:分子的吸收能量发生跳跃,吸收光子的波长和吸收信号的强度为分子吸收光谱,否则为分析发射光谱。
光谱分类:分子平移、分子旋转、化学键振动、电子能级跃迁、电子自旋、同位素核自旋。
1?核磁共振波谱(NMR)
核磁共振:一种研究磁场中原子核能级和跃迁的光谱方法。-分子结构和分子间关系
基本原则:
?原子核的自旋运动:只有自旋非零的原子核才能与外磁场相互作用,具备核磁共振的条件;
?原子核动量矩和磁矩的空间量子化(原子核在外磁场中的行为):在强磁场的激发下,某些具有某种磁性的原子核的能量可以分为两个或两个以上的能级。?
?核磁共振* * *振动的产生:此时,当加入一个能量,使其恰好等于分裂后相邻两个能级之差时,原子核就可能吸收能量(称为* * *振动吸收)。
从低能态到高能态,吸收的能量的多少相当于频率范围为0.1~100MHz的电磁波(属于无线电波范畴,射频)。所以核磁共振就是研究磁核对射频能量的吸收。
1.1?弛豫过程-谱线宽度
纵向弛豫(自旋-晶格弛豫):高能核与周围环境(固体晶格、液体中的溶剂分子等)进行能量交换的过程。).
横向弛豫(自旋-自旋弛豫):高能核转移能量到相邻低能态核的过程。
谱线宽度的影响因素:弛豫时间、仪器磁场的均匀性和顺磁材料。
1.2?化学位移δ
化学位移:原子核在不同的化学环境中被不同的电子屏蔽,其* * *振动频率不同,在核磁共振谱的不同频段或不同磁场中会出现* * *振动吸收峰。
化学位移的表示方法:相对位移,以一种物质的* * *振动峰(TMS)为原点,对样品中质子的* * *振动峰与原点的相对距离进行排序。-数据的统一。
1.3?核磁振动仪
乐器分类:?
?无线电频率:60兆赫,100兆赫,600兆赫……...?
?磁体类型:永磁体、电磁体、超导磁体...?
?射频源:连续波,脉冲傅立叶变换...?
仪器结构:
2.质谱分析
质谱是一种利用电场和磁场,根据运动离子(带电原子、分子或分子碎片、分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用产生的离子)的质荷比来检测它们的方法。
应用:化合物结构的化学分析,定性和定量...
2.1?采用质谱法的原因
通过测量离子的精确质量,可以确定离子的化合物组成。因为核素的准确质量是小数,没有两个核素的质量会相同,也没有一个核素的质量是另一个的整数倍。
2.2?基本原理
样品进入质谱仪。在质谱仪的离子源中,化合物被电子轰击,电离成分子离子和碎片离子。这些离子在质量分析仪中按照质荷比的顺序进行分离,经电子倍增器检测后即可得到化合物的质谱。
2.3?质谱图
横坐标:质荷比?
纵坐标:离子强度?
离子的绝对强度:样本大小和仪器灵敏度?
离子的相对强度:样品分子结构的相关性?
同一样品的质谱在一定的电离条件下是相同的。这是质谱进行有机定性分析的基础。
2.4?质谱仪器的主要结构
二、色谱分析方法
一种分离分析方法;?
特点:有两相——固定相和流动相,两相相对运动。
分离原理:流动相中携带的混合物通过固定相时,会与固定相发生相互作用。由于流动相中每种组分的性质和结构不同,与固定相相互作用的程度也不同。因此,在相同的推动力下,不同组分在固定相中的保留时间或长或短,所以它们以不同的顺序从固定相中被冷落。
影响1.1组分分离的因素
1.2色谱的基本理论
A.色谱分布平衡
色谱分配平衡:组分在固定相和流动相之间吸附、解吸或溶解、挥发的过程——分配过程。在一定温度下,两相之间的分配达到平衡时各组分的浓度比称为分配系数;质量比称为分配比。
分配系数:色谱分离的本质。
B.托盘理论
塔板理论是借助化工中塔板理论的概念推导出流出曲线方程。
把色谱柱比作蒸馏塔,想象一个连续的色谱柱是由许多小段组成的。在每个小片段中,一部分空间被固定相占据,另一部分被流动相填充。组分随流动相进入色谱柱后,在两相之间分配。假设各组分在每一小段内都能很快达到两相中的分配平衡,这样的小段称为理论板,理论板的长度称为理论板高h,经过多次分配平衡后,分配系数小的组分先离开蒸馏塔,分配系数大的组分离开蒸馏塔。由于色谱柱中的塔板数相当多,即使组分分配系数只是略有不同,仍可获得良好的分离效果。
a)组分浓度与时间的关系:流出曲线方程
解释的问题:色谱峰型和最大浓度位置。
b)色谱柱的理论板高是每单位柱长色谱峰的方差。
理论塔板高度越低,单位长度塔的塔板数越高,分离效果越好。
决定理论塔板高度的因素有:固定相的材质、色谱柱的均匀性、流动相的理化性质和流动相的流速。
c)理论塔板数&;有效塔板数
有效塔板数:取决于固定相的类型和性质(粒径、粒径分布等。)、填充条件、柱长、流动相的类型和流速以及用于确定柱效的物质的性质。
d)塔盘理论的特点和缺点
塔板理论方程符合色谱流出曲线,为色谱理论提供指导。
当用(有效)塔板数和(有效)塔板高度来衡量柱效指数时,应规定具体的物质(不同的物质在同一色谱柱上有不同的分配系数)。?
影响柱效的本质没有搞清楚。
?柱效不能代表被分离组分的实际分离效果;?
?无法指出影响柱效的因素和提高柱效的途径。?
不能解释载气率对理论塔板数的影响?
?无法解释同一色谱柱在不同载气流速下不同柱效的实验结果。
C.速率理论
根据速率理论,单个组分分子必须在色谱柱中的固定相和流动相之间经历数千万次的转移。再加上分子扩散和运动路径等因素,其在柱内的运动具有高度的不规则性和随机性,其在柱内随流动相前进的速度是不均匀的。
a)范迪默方程(范迪默速率理论方程)
b)涡流扩散项
f)提高色谱柱效率的措施
选择颗粒较小的均匀填料;
在不使固定液粘度增加太多的前提下,尽可能在最低的柱温下操作;
使用实际浓度最低的固定液;?
较大分子量载气;?
选择最佳载气流速;采用内径较小、曲率半径较大的圆柱形。
D.分离度
分离度:描述物质的实际分离效率(塔板理论和速率理论难以描述)。
分离度的影响因素:热力学因素(保留值)和动力学因素(峰宽、柱效)。?
分离度是多少?
①柱效高,分配系数大,分离完全;?
②分配系数不是很大,柱效高,峰窄,基本完全分离;?
③柱效低,分配系数大,但分离不好;?
④分配系数小,柱效低,分离效果差。
1.3?气相色谱法
以气体为流动相的色谱分析方法;
适用于易蒸发、稳定、难分解、难反应的样品的分离分析,尤其适用于同系物和异构体的分离。
a)气相色谱的基本原理
b)气相色谱仪及其主要结构
1.4?高效液相色谱(HPLC)
以液体为流动相的色谱法;?
适用于分离高沸点、热不稳定的离子样品。?
经典液相色谱:分离手段;高效液相色谱:分离和分析。
基本原理:色谱过程中,不同组分在相对运动且不互溶的两相之间进行交换,相对静止的相为固定相,相对运动的相为固定相。利用吸附、分布、离子交换、亲和力或分子大小的微小差异,通过两相之间的连续质量交换分离不同的组分。
四种类型:吸附色谱法、分配色谱法、凝胶色谱法和离子色谱法。
a)液相色谱仪的主要特点和主要结构
3.分析仪器组合技术(气相色谱-质谱、液相色谱-质谱……...)
3.1分析仪器组合技术概述
分析仪器组合技术:将两种或两种以上的分析仪器组合起来,得到快速有效的分析工具的技术。?
色谱最大的特点是能将复杂混合物分离成单一组分,但定性和结构能力较差。
通过质谱和其他技术很容易确定纯组分的结构。
分析仪器的组合形成了对混合物质的完整分析。
3.2分析仪器组合中的重要问题
接口问题,它的一般要求如下:?可以进行有效的样品转移;?
?样品转移应具有良好的再现性;?
?容易满足两种仪器的任意运行方式和条件;?
?样品不会通过界面发生化学变化;?
?不影响仪器效率;?
?样品尽可能快地通过界面;?
?界面本身简单、方便、可靠。
3.3气相色谱-质谱法(GC-MS)
它结合了气相色谱和质谱的优点,具有气相色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度和强分辨能力。
适用于小分子、挥发性、热稳定性和气化化合物;
通过电子轰击(EI)获得的谱图可以与标准谱图库进行比较。
3.4高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术
LC-MS可以解决以下问题:
?不会发化合物分析测定;?
?极性化合物的分析和测定;
?热不稳定化合物的分析和测定;
?高分子量化合物(包括蛋白质、多肽、聚合物等)的分析和测定。);?
?如果没有商品,光谱库可以对比查询,只能自建库或者自己分析光谱。?
需要解决的重要问题:?
?液相色谱流程对质谱工作条件的影响:?
?质谱离子源温度对液相色谱分析源的影响。
3.5?气相色谱-质谱联用仪。液相色谱-质谱联用技术仪器的主要结构