虎眼万年青多糖的分离纯化及性质研究
1前言
多糖是自然界中存在的醛糖和/或酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物。多糖是所有生命体的必需成分，与维持生命的各种生理功能密切相关。近年来，来自植物、海洋生物和真菌的多糖已成为一类重要的具有生物活性的天然产物，多种多糖被发现具有抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒等活性。多糖具有复杂的结构，因为它有许多不同的单糖残基，不同的连接位置和不同类型的糖苷键，可以形成不同构象，不同相对分子量，链内和链间氢键的二级结构。
对多糖的研究始于20世纪40年代，但它作为一种广谱免疫增强剂在60年代引起了极大的关注。经过40多年的不断发展，人们对多糖这一重要生命物质有了新的认识，使该学科成为生命科学中最活跃的研究领域之一[1]。越来越多的研究发现多糖对人体有很大的利用价值，按来源可分为三类:动物多糖、植物多糖和微生物多糖。其中，人参、黄芩、刺五加、芦荟等植物多糖具有明显的药用功效，如增强免疫、抗肿瘤、抗辐射等作用。据文献[2]报道，已分离提取了近100种植物多糖。这类多糖来源广泛且无细胞毒性，应用于生物体时毒副作用小，因此对植物多糖的研究已成为医学领域的热点。
多糖(PS)也叫多糖。它存在于动物、高等植物、微生物(细菌和真菌)和藻类中。多糖具有复杂、多方面的生物活性和功能，可作为一种具有免疫调节功能的广谱免疫促进剂。比如多糖可以治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至可以抵抗艾滋病病毒[3]；还具有抗感染、抗辐射、抗凝血、降血糖、降血脂的作用；促进核酸和蛋白质的生物合成；它能控制细胞分裂和分化，调节细胞生长和衰老，而多糖作为药物毒性很小，因此对多糖的研究引起了人们极大的兴趣。多糖的分子量有数万或数百万。植物多糖包括淀粉、纤维素、葡聚糖(如香菇多糖)、果聚糖胶、粘液、粘胶(如琼脂)等。其中一些是癌细胞抑制剂，但其特异性较差。80年代德国Franz G等研究组最为活跃，证明了许多植物多糖和真菌多糖具有抗肿瘤活性。这包括香菇多糖、Ps-K、云芝、猪苓等，已经应用于临床。
多糖在医学上也是很好的佐剂。近年来发现多糖的糖链在分子生物学中起着决定性的作用。此外，它还能控制细胞分裂和分化，调节细胞生长和衰老。多糖还广泛应用于食品工业、发酵工业和石油工业。越来越多的植物多糖被新开发，其在食品领域的应用价值得到开发和证实，为食品工业的快速发展注入了新鲜的活力。近年来，随着人们对多糖和糖缀合物在生命科学中作用的认识，以及多糖研究技术的快速发展和完善，多糖研究如雨后春笋般涌现，国际科学界将多糖研究视为生命科学的前沿领域，甚至提出21世纪是多糖的世纪[4]。许多植物多糖具有免疫调节活性，能增强巨噬细胞、淋巴细胞等免疫系统的功能，激活或促进抗体和补体的产生，诱导干扰素。多糖还可用于防治糖尿病，促进胃溃疡的愈合和修复，并具有抗辐射、降血脂等多种功能。因此，多糖及其衍生物作为生物效应调节剂，已成为近年来天然药物的研究热点之一。
因此，研究多糖的分离纯化具有重要的现实意义。本文主要研究醇沉分级、柱层析等。
2实验部分
2.1主要试剂和仪器
葡聚糖DEAE系列，Pharmacia公司
唾液淀粉酶，美国适马公司
SDS凝胶
考马斯蓝试剂
β-葡萄糖基衍生物试剂
其他试剂为分析纯。
PD 10柱，amersham harmcia生物技术公司。
自动流量分离收集器
RE52CS旋转蒸发器，上海医疗机械专用机器厂。
6010紫外-可见分光光度计，安吉尔上海分析仪器公司。
美国沃特世公司2690型高效液相色谱仪
2.2实验方法办公室办公室"/>
2.2.1淀粉去除
虎眼万年青粗多糖配成20%水溶液，在37℃下用唾液淀粉酶去除淀粉。
蛋白质去除
Sevage法去除蛋白质:在样品水溶液中按体积比4: 1(比例为5: 1)加入氯仿和正丁醇，离心(10000rpm，20min)去除凝胶状蛋白质，重复数次(3次)，直至蛋白质完全去除。用茚三酮反应检测除蛋白效果，结果为阴性(或缩二脲试验)；同时在200~280 nm处测量脱蛋白后样品的紫外吸收曲线来检验效果。脱蛋白后多糖溶液的紫外吸收峰在260 ~ 280 nm处消失，表明多糖中不含蛋白质。
脱盐
使用半透膜，用反向流水透析上述处理溶液以除去小分子杂质如低聚糖，然后用蒸馏水透析48小时。
酒精沉淀分类
将粗多糖15g+250mlH2O加热溶解，冷却，加入40%乙醇沉淀，搅拌，静置，过滤，得沉淀(OC-1)，用40%乙醇沉淀3次，合并滤液，浓缩。
将浓缩液用60%乙醇沉淀，搅拌溶解，静置，过滤，得到沉淀物(OC-2)。滤液用60%乙醇沉淀3次，合并沉淀。获得滤液(60%乙醇溶液)(OC-3)。
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发布于2009年2月9日14: 17 |仅由作者发布。
2.2.5柱分离交通"/>
将60%乙醇沉淀(OC-2)溶解在热水中，并在烧杯中与葡聚糖凝胶DEAE树脂混合。平衡后，将树脂置于分液漏斗中，用0.5 mol/L NH4CO3溶液洗涤，分为两个组分:0.5 mol/L NH4CO3溶液的洗脱液(OC-2-1)和与树脂结合的组分(OC-2-2)。
蒸发0.5mol/L碳酸氢铵溶液的洗脱液(OC-2-1)，溶于水，上DEAE柱(4.5×12.0)，再用0.2mol/L碳酸氢铵溶液洗脱，测定各洗脱液的OD值。根据收集管的数量绘制洗脱曲线。将具有相同峰的组分合并产生七种组分:OC-2-1-a(未结合部分)、OC-2-1-b、OC-2-1-c、OC-2-1-d和OC-2。
用紫外分光光度计在215和280nm波长下测定上述不同组分的吸光度OD值。
在低于60℃的减压下将组分蒸发至干，然后用PD 10柱(Sephadex G-25M)除去盐和小分子。
在DEAE树脂柱上用60%乙醇沉淀溶解一些热水，使用不同浓度的碳酸氢铵:0.2M、0.25M、0.4M、0.5M、1.0M