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介孔分子筛SBA？以表面活性剂pour onic p 123(EO 20 po 70 EO 20，美国Aldrich公司)为模板，浓盐酸(35% ~ 37%)为催化剂，合成了15。原硅酸乙酯(Si(OC2H5)4，TEOS，95.0%，Junsei化学公司。编号为Lu001和LLSD1的介孔分子筛的合成方法基本相同，只是原料略有不同。它们的BET比表面积为762 m2/g，孔容为0.87 cm3/g，孔径为7.65438±0.8nm，壁厚为3.55nm..假丝酵母脂肪酶(CRL)购自日本Amano Enzyme Technology公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。实验用水是二次蒸馏水。
2.2傅里叶变换红外(FT？IR)测试
样品和KBr在115℃真空干燥10 h。将300 mg KBr和2.2 mg样品混合并在研钵中研磨成细粉，然后压制成片剂。干燥后，立即将它们放入红外光谱仪的应时原位池中进行测试。仪器分辨率为2 cm-1，扫描波数范围为4000 ~ 400cm-1，扫描次数为128次。
SBA中的2.3 CRL？15上的固定
将CRL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)以3000 r/min离心65438±05min，收集上清液得到原酶液。适量的SBA会怎么样？将15放入胶原酶溶液中，在15℃水浴中以150 ~ 200 r/min搅拌吸附210000 r/min，然后以10000 r/min离心15 min，收集上清液作为萃余液。用磷酸盐缓冲液洗涤分子筛4次，洗脱松散附着的酶，将洗脱液以10000 r/min离心15 min，取上清液作为清洗液。测定原酶液、萃余液和清洗液的酶蛋白含量，根据物料衡算计算酶蛋白的固定量(Mg)，以单位质量分子筛的酶蛋白固定量作为酶负载量(Mg/g)。
2.4固定化CRL的泄漏
上面提到的载酶SBA？将15转移到70 mL磷酸盐缓冲溶液中，在15℃水浴中以150 ~ 200 r/min搅拌，定期取样。将样品以10000 r/min离心15 min，分析上清液中酶和蛋白质的渗漏情况。
2.5蛋白质定量方法
分别采用单波长紫外分光光度法、双波长紫外分光光度法和BCA法测定样品中蛋白质的含量。单波长紫外法的公式为:C(蛋白质)(g/L) =F×A280×D/d，其中A280为280 nm波长处的吸光度，D为溶液的稀释倍数，D为应时比色皿的厚度(cm)，f为校正因子。Warburg，双波长紫外法？基督教公式为:c(蛋白质)(g/l)= 1.55 a280-0.76 a260；劳瑞？Kalckar的公式为:c(蛋白质)(g/l) = 1.45A280-0.74A260其中A260和A280分别为260 nm和280 nm处的吸光度。BCA法是根据美国Pierce公司的蛋白质定量法测定的。分析化学第37卷第8期商演等:介孔分子筛SBA？脂肪酶固体定量分析法测定15 3.1蛋白质定量方法的比较
图1显示不同浓度的CRL溶液在260~280 nm处有一个强吸收峰，是蛋白质中芳香族氨基酸的特征峰，用于蛋白质含量的测定。将粗酶浓度为6 g/L的CRL溶液在不同时间稀释，得到一系列已知相对浓度的酶溶液。分别用单波长和双波长紫外法和BCA法测定酶的浓度，验证测得的浓度比与其相对浓度是否一致，从而得出各检测方法的准确性。图2中的结果表明，BCA法的测定结果与稀释样品的相对浓度最接近，双波长紫外法的测定值与BCA法接近，单波长法的测定结果远高于BCA法和双波长紫外法。根据表1中相对浓度的计算结果，BCA法的相对误差最小，单波长和双波长紫外法的相对误差较大。这是因为BCA法的原理是CuSO4中的Cu2+螯合蛋白质分子，发生显色反应来测试吸光度，所以抗干扰能力强，准确度高。紫外分光光度法操作步骤少，简单快速，不需要显色剂，不消耗样品。而直接检测光密度值受溶液中杂质的干扰影响较大，误差较大。
为了考察介孔分子筛对吸光度的影响，0.1、0.6和0.9 mg SBA？15(没有Lu001)，以蒸馏水为参比样品，测定其吸光度，计算蛋白质测定可能引起的浓度偏差。表2显示SBA？15有明显的紫外吸收。因此，本实验中的样品溶液以10000 r/min离心，以消除介孔分子筛对吸光度的干扰。表1不同方法测定蛋白质浓度表2 SBA？15对吸光度的影响表3显示了通过不同定量方法测定的SBA。CRL的固定金额由15(无Lu001)且三次平行实验的初始粗酶浓度均为6 g/L，SBA？15载体用量为0.36 g，双波长紫外法测定结果略高于BCA法。单波长紫外法的结果远高于双波长法和BCA法。表3还表明，BCA法的精密度高于单波长和双波长紫外法，因为BCA法依靠显色反应检测吸光度，灵敏度高，而介孔分子筛不参与显色反应，抗干扰能力强，重现性好，更适合检测介孔分子筛载体的酶固定量和酶渗漏量；紫外分光光度法按溶液中的杂质和残留介孔分为三个表:SBA？15上CRL和酶加载的固定量
◆:固定化蛋白质的量；◇:加酶量。子筛干扰大。由于双波长紫外法测定酶固定化的结果与BCA法接近，如果实验条件有限或为了不消耗样品干扰因素少，可以用双波长紫外法代替BCA法测定酶固定化，各样品中介孔分子筛的干扰可以通过物料衡算来抵消。
3.2不同初始酶浓度下的BSA？15载体上酶的固定量
BCA法测定不同初始酶浓度下LLSD1对CRL的固定量。图3显示，当酶浓度较低时，SBA？15载体在CRL上的固定量和酶载量随酶浓度的增加呈线性增加，但当酶蛋白浓度达到0.29 g/L左右(粗酶浓度约为1 g/L)时，固定量和酶载量达到一个稳定水平，最大酶载量为114.2 mg/g。
3.3两种SBA？15载体的酶固定量
在初始酶浓度为2 g/L和分子筛用量为0.12 g的相同条件下，LLSD1和LU01在CRL上的固定化图4 LLSD 1(a)和Lu001 (b)的SEM照片。
llsd 1 (a)和lu001 (b)的图4 SEM图像的量分别为13.70和2.00mg；酶载量分别为114.2和16.6 mg/g。可以看出LLSD1的固定量和酶载量远大于Lu001。图4显示了LLSD1和Lu001的SEM照片。可以看出它们的外观和形状基本一致，都属于SBA？15 [9]的传统造型在大小上没有明显区别。图5显示了LLSD1和Lu001的FT。从红外光谱可以看出，LLSD1表面的羟基数大于Lu001。由于酶的吸附是通过酶与介孔材料表面的羟基之间的氢键作用完成的，所以介孔分子筛表面的羟基可以通过氢键作用促进酶的吸附[10]。因此，FT？图5中的Lu001(1)和LLSD1(2)？红外光谱图
图5英尺？鲁001 (1)和1 (2)固定化酶红外光谱的差异可能与介孔分子筛的羟基含量有关，羟基含量越高有利于更多CRL的固定化。
3.4 SBA？15固定化酶泄漏
固定化酶容易“脱落”到水相，成为游离酶，即“漏”[11]。图6显示，在100 h后，Lu001的固定化CRL在缓冲溶液中的渗漏率为0.56%，LLSD1的渗漏率为0.53%，表明渗漏量低。15是酶固定化的良好载体。泄漏率低可能与SBA有关？15孔径。研究[3，12]表明，当介孔材料的孔径大小适合酶分子的大小时，固定化酶的稳定性较好。Lu001和LLSD1的孔径均为7.18 nm，假丝酵母脂肪酶的动力学直径约为5 nm，使得酶分子刚好固定在孔中，不易泄漏。
◆、■、▲、●是漏；◇、△、◇为渗漏率，其中◆、◇: 0.12g LLSD 1，酶载量114.2mg/g；■、口:0.24 g LLSD1，加酶量111.3mg/g；▲、△: 0.36 g Lu001，酶载量14.2mg/g；●、○: 0.36 g lu001、酶载量16.6 mg/g. 1雷C、申Y、刘J、阿克曼E J .美国化学会学报，2002年，124:11242 ~ 11243
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