亲和色谱在生物科学中的应用与发展——荣杰生物色谱

摘要:近几十年来,亲和层析技术发展非常迅速,广泛应用于生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸和多糖)和组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离纯化。),是蛋白质组学研究中的重要技术之一。介绍了亲和色谱的基本类型和配体合成的研究进展,总结了亲和色谱在蛋白质组学等领域的应用和发展趋势。

关键词:亲和层析;基本原则;类型;app应用

中国图书馆分类号:Q819

文件识别码:a

货号:1007-7847(2006)01-0012-06。

亲和色谱是一种利用偶联的亲和配体的亲和吸附介质作为固定相,吸附目标产物,从而分离纯化目标产物的液相色谱。近几十年来,亲和层析技术发展非常迅速,在生物技术产品、生物分子和组织的分离纯化方面取得了显著的成就。现已广泛用于分离纯化蛋清、肽、酶及其底物和抑制剂、抗体和抗原、核酸及其特异性效应物、激素和受体、细胞和细胞表面等。基于此,本文介绍了亲和层析的基本类型、配体的选择以及亲和层析在生物学特别是蛋白质组学中的应用。

1亲和色谱的类型

亲和层析柱中的固定化配体是决定亲和层析成功的关键因素。根据配体与生物大分子相互作用体系的不同,亲和层析可分为以下四种类型。

1.1生物亲和色谱(BAFC)

生物亲和色谱是一种亲和色谱,它使用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对。通常具有高选择性。典型的物质对包括酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。

1.2免疫亲和层析(1AFC)

免疫亲和层析是一种分离系统,使用抗原和抗体中的一种作为配体,亲和吸附另一种。免疫亲和层析被广泛使用。许多典型的亲和层析方法使用单克隆抗体作为亲和配体。目前可以利用抗体-抗原模型获得针对每种目的蛋白的单克隆抗体,然后以单克隆抗体为配体,通过亲和层析技术分离纯化目的蛋白。该方法具有很高的纯化多重活性回收率。蛋白A和蛋白C作为抗体结合蛋白,已应用于免疫亲和层析,是免疫亲和层析分析人免疫球蛋白特别是IgG类抗体的良好配体。免疫层析柱的各种类型的免疫检测称为免疫检测法,特别适用于检测含量较低的样品。免疫测定使用标记抗体或模拟分析物进行间接分析。通常使用诸如酶标记、荧光标记和化学荧光的标记。

1.3金属离子亲和色谱(IMAC)

金属离子亲和层析是一种利用金属离子的络合物或形成整合体的能力来吸附蛋白质的分离系统。蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基,如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基,非常有利于蛋白质与固定化金属离子的结合,是IMAC分离纯化蛋白质的基础。已经发现金属离子,如锌和铜,能很好地结合组氨酸的咪唑基团和半胱氨酸的巯基。含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析来分离。

1.4仿生亲和色谱(仿生)

仿生亲和色谱是利用某些分子之间的相互作用来模拟生物分子或特定部位的结构。用合成配体作为固定相吸附蛋白质的亲和层析,如染料亲和层析(DAFC)和氨基酸亲和层析(包括多肽亲和层析(AALA))。染料配体,如三嗪或三苯甲烷化合物,可以通过价键牢固地结合到母体和载体上。染料配体与许多蛋白质和酶的活性位点相互作用,以模拟这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂。

亲和色谱配体的设计及组合方法筛选配体

亲和层析是一种非常有效的大规模纯化生物技术产品的分离技术,已广泛应用于蛋白质组学等领域。虽然它有很大的潜力,但亲和层析的应用受到是否能为每个靶获得合适的配体的限制。近年来,结合分子模型设计和组合化学已成为一种创新的方法,生产新的和特定的生物技术需要的特定配体。

2.1亲和色谱配体的设计

根据蛋白质结构设计配体:合理设计配体的策略包括从合适的数据库中获得关于目标蛋白质的结构信息,并确定蛋白质上可能的结合位点。靶位点可以是活性位点、暴露于溶剂的区域或参与相同中性互补配体结合的位点。根据蛋白质结构设计配体需要考虑两个重要因素:一是正确预测设计的配体图像的能力;第二,正确预测配体亲和力的能力。已经报道了一些利用蛋白质设计配体的成功方法。例如,为L-乳酸脱氢酶设计的蒽醌模拟生物染料配体。

根据蛋白质功能设计配体:当目标蛋白质的三维结构未知时,可以根据蛋白质的功能设计配体,并依赖于考虑配体的某些结构特征。总结如下:

1)满足一定要求的分子形状。例如,线性负电荷分子肝素是纯化DNA结合酶的常规方法。此外,用于纯化核苷酸结合酶的配体三嗪染料CibacronBlue 3GAca具有与一些酶的核苷酸结合位点形成适当相互作用所需的几种结构、离子和疏水基团。

2)配体具有特定的官能团。比如苄脒作为胰蛋白酶的配体,羟基氨基酸作为金属结合蛋白的配体。

3)来源于两种或多种已知结构基序(如底物、抑制剂、效应物或辅因子)组合的结构模式。例如,酮-羧基仿生嵌合染料-配体被设计为用于纯化识别(酮)羧基的酶的配体。

2.2筛选配体的组合方法

利用组合化学建立多肽库,然后利用多肽库筛选与目的蛋白特异性结合的多肽配体,极大地促进了亲和层析筛选和配体合成技术的发展。在过去的十年中,已经有方法可以产生多达10种不同的蛋白质、肽链或核酸文库。如此大的文库使得选择具有高亲和力和特异性的分子成为可能。当寻找配体时,可以应用两种策略。首先在各种类型的大文库中筛选出能与生物分子结合的靶标,然后引入一种设计方法来减小导向文库的大小。这种采用的方法主要取决于我们一开始有什么信息。如果有关于分析物结构的信息,就有可能设计配体。然而,如果没有这些信息,组合方法可能是筛选配体的唯一方法。从第一代文库获得的结合分子可以用作基质支架来产生其他新的文库,从中可以筛选更高活性的结合配体。已经报道了从(多)肽、多核苷酸和取代的三嗪化合物的文库中筛选亲和配体的组合方法的应用。

2.2,1合成肽库

合成肽库是随机肽分子的集合,包含给定肽链长度的所有可能序列。固相肽合成法化学合成肽分子。合成的肽可以从可溶性肽文库中断裂,或者保留在珠中具有一种结构的肽文库的树脂上。体外筛选组合化学文库的一个基本方法是让文库中的混合物流过一个通道,该通道上已经固定了待检测的蛋白质。对固定在表面上的蛋白质分子具有亲和力的配体是在其通道中被抵抗的肽,并且它们通常是亲和层析配体的良好候选物。这样,具有F-L-L-V-P-L序列的肽配体已被合成并用于纯化人纤维蛋白原。

2.2.2噬菌体展示

噬菌体展示技术已经迅速成熟,并发展成为亲和层析寻找高亲和力配体的工具。这项技术是基于使用噬菌体展示文库在一个称为生物淘析的筛选过程中快速鉴定高选择性配体。噬菌体展示的肽可以通过两种方式用亲和法选择。该文库可以直接与固定的靶一起培养,或者在固定在固体支持物上之前与靶一起预培养,就像亲和层析一样,相互作用的肽或蛋白质被特异性或非特异性地洗脱。细菌感染可以扩增这些相互作用的噬菌体,增加它们的拷贝数。该筛选/扩增过程可以重复多次,以获得具有高亲和力的噬菌体展示肽。通过对分离的噬菌体DNA序列进行测序,可以获得所需的序列。噬菌体展示文库已成功应用于表位定位、疫苗开发、蛋白激酶底物的鉴定、生物活性肽和非肽配体的肽模拟,非常适合作为色谱分析的亲和配体来源。蛋白A的免疫球蛋白结合结构域已经展示在噬菌体的表面上,这使得筛选具有改进的特异性或温和洗脱条件的蛋白A变体的亲和层析条件成为可能。Gaskin等人描述了使用丝状噬菌体M13表面展示的7-氨基酸肽库作为Rhizomucormiehei脂肪酶亲和配体的可能来源。

2.2.3通过SELEX的核糖体展示和亲和力选择

核糖体展示特别适合扫描筛选折叠的蛋清。原理总结如下:首先将一个DNA文库转录成mRNA,在体外进行翻译。由于缺少终止子,阻止了mRNA和肽从核糖体上释放出来,在适当的条件下形成稳定的三元复合物。然后将复合物暴露于固定在表面上的目标分子。如果肽以足够的亲和力与靶结合,则复合物保留,低亲和力的肽被洗去,附着的核糖体三元复合物可被EDTA解离,mRNA可被逆转录成cDNA并通过PCR扩增。SELEX广泛用于筛选核酸配体,并且体外筛选已经用于确定靶的核酸配体。这些目标覆盖大范围的体积,包括简单离子、肽链等。

在过去的几十年中,合成化学配体在蛋白质色谱中的作用是非常真实的。离子交换、疏水、金属螯合吸附剂共同构成固定在基质骨架上的某种超稳定、无毒的人工合成功能体,与蛋白质表面的带电、非极性或金属结合基团具有亲和力。例如,组合化学技术开始对新的融合肽金属配体的发现和设计产生巨大影响。

2.3配体的从头设计

由于X射线晶体学、NMR或同源结构的知识可以与有限或组合化学合成和先进的计算机技术相结合,因此合理设计亲和配体变得更加可行、有效、合理和快捷。这种方法依赖于靶蛋白的结构信息,有目的地指导配体的合成,并将合成努力限制在已经通过实验评估的、可以与检测到的靶结合或预期与靶结合的方向。该方法包括以下步骤:在靶蛋白上选择合适的位点,设计与该位点的三维结构相容的配体,将其结合到结构相关的固相结合配体文库中,并在该文库中扫描靶蛋白。

根据蛋白A的B结构域和lgG的Fc片段组成的复合物的X射线晶体结构,建立了IgG的非肽仿生配体。利用计算机辅助分子模型,围绕蛋白A二肽Phel32-Tyrl33设计了一系列仿生分子。一个这样的配体可以与人IgG结合,其在三嗪环上具有3-氨基苯酚和4-氨基-1-萘酚部分。当这种仿生配体被固定在琼脂糖上时,它已被成功地用于纯化人血浆IgG。还建立了为重组胰岛素前体M131和重组人凝血因子vlar 351设计的仿生配体的类似方法。

亲和色谱的应用

3.1亲和层析在蛋白质组学中的应用

双向电泳和质谱是蛋白质组学中最常用的实验技术。然而,亲和层析也是一种重要的分离方法。在蛋白质被2-DE分离之前,亲和层析主要用于选择性预浓缩和预处理样品。它应该包括去除一种或一类会干扰2-DE分辨率的蛋白质。一个典型的例子是通过亲和树脂吸附去除血清和脑脊液样品中的白蛋白和免疫球蛋白IgG,可以显著提高2-DE凝胶上蛋白点的分辨率。此外,亲和层析可以浓缩低丰度的蛋白质,以便在双向凝胶上可以看到它们。所有的蛋白质也可以分为两类或更多类,以便进一步分析。

在许多情况下,那些没有被2-DE分离的样品是通过质谱测定的,在测定之前可以使用亲和层析来分离它们,以降低样品的复杂性。对于非基于2-DE的研究,亲和层析可用于在蛋白质水解和消化之前或之后分离蛋白质和肽链。例如,凝集素亲和层析已被用于在蛋白水解和消化后分离和提取一类特殊的糖蛋白,以及浓缩糖肽。这种方法对于研究转录后修饰的蛋白质特别有用。亲和层析也用于研究转录后修饰的位点。亲和层析用于分析糖蛋白,糖蛋白即使在蛋白质水解后也能被凝集素识别。使用抗体和一些IMAC的亲和层析可用于分离和浓缩糖肽。

理解细胞如何作为一个系统运作取决于确定细胞蛋白质相互作用的复杂网络。蛋白质复合物亲和纯化后的蛋白质谱鉴定已经成为在精细细胞中生成蛋白质-蛋白质相互作用图和复杂定位图的有力工具。所有用于鉴定蛋白质复合物的亲和纯化方法都是通过在基因水平或从细胞中提取蛋白质的水平上标记蛋白质来进行的。蛋白质亲和层析可能优于酵母双杂交方法,因为它产生更少的假阳性结果,并且更适合于高通量(大量待检测样品)操作。亲和层析可以纯化在细胞中形成复合物的蛋白质,并且可以从例如细胞裂解物中与那些相关的蛋白质一起纯化目标蛋白质。重组DNA技术使用肽片段标记如GST、表位或TAP来标记“诱饵”蛋白质。大规模的方法可以用这些商业肽标记所有的诱饵蛋白。包含TAP标记的蛋白质的蛋白质复合物通过两个连续的亲和步骤纯化:lgG珠和钙调素珠。

虽然双向电泳和串联质谱的并行方法已经能够相对定量双向电泳凝胶中的蛋白质,但是使用稳定同位素标记可以实现蛋白质组学的定量分析。一类小分子试剂,同位素编码的亲和标记,已被用于蛋白质组学的定量分析。一种方法是在MALDI-TOF质谱仪和ICAT标记试剂的帮助下分析复杂的蛋白质混合物。

3.2目标蛋白的分离、纯化和定量测定

近年来,生物制药工业的快速发展使得亲和色谱作为临床药物分离、纯化和定量测定的重要工具得到了广泛应用。亲和层析最常用于目的蛋白的分离纯化,尤其是疫苗,尤其是融合蛋白的分离纯化,因为融合蛋白具有特异性结合能力。亲和层析广泛应用于基因工程亚单位疫苗的分离纯化,其中Ni-NAT和GST亲和层析广泛应用于带有(His)6和GST亲和标记的融合蛋白。金属螯合色谱法和免疫亲和色谱法也在一定程度上得到应用。

近年来将亲和层析原理应用于定量分析,主要结合免疫技术分析抗原和抗体,发展了放射免疫、酶标免疫、荧光抗体等技术。此外,亲和层析技术还广泛应用于测定与生物大分子及其特定底物的结合常数和复合物的定量分析。亲和层析已广泛应用于临床,如糖基化蛋白的定量分析。此外,将抗人转铁蛋白固定化的免疫亲和层析柱应用于稀释血清转铁蛋白异构体的纯化和鉴定。

3.3识别生物分子之间的相互作用

亲和层析也用于研究生物系统中生物分子之间的相互作用。该领域已用于测试各种生物系统之间的相互作用,包括凝集素//糖、酶/抑制剂、蛋清/蛋白质和DNA//蛋白质。在临床上,该技术主要用于研究药物或激素与血清蛋白之间的结合。有两种色谱方法可以用来研究生物之间的相互作用。一个是区域洗脱研究,另一个是前沿锋面分析研究。

3.4亲和色谱结合其他分析技术

近年来,另一个发展趋势是寻求更优化的系统设计和安排,以获得快速、优异的选择性和大量的测试样品。亲和层析可以与其他分析技术相结合来实现这一目标。目前,已经有许多成功的应用,如亲和色谱-质谱(AFC-MS)、AFC -HPLC、AFC-HPLC-MS、AFC-CE(毛细管电泳)等。这种结合由于其不可替代的优势,将会继续发展。

4结论

寻找和生产用于治疗疾病的蛋白质的挑战使得人们有必要重新考虑设计和纯化过程。这种选择主要由该方法的引入速度、有效性、稳定性和经济负担能力决定。基于亲和层析的高选择性和成熟策略正在取代传统的纯化程序。这项技术为纯化提供了合理的设计,并刺激和探索了分子识别的自然生物过程,以选择性纯化目标蛋白质。亲和层析可能是关注高通量和蛋白质组学关键问题的唯一分离技术。主要的问题是设计新的技术来确定高选择性的亲和配体结合假设的目标。用理性和组合的方法设计高选择性和稳定性的配体将对亲和色谱的未来应用产生重大影响。鸣谢:特别感谢梁松平教授、张健教授和曾博士对本文提出的宝贵意见!本文为原文全文。没有PDF浏览器的用户应该先下载并安装原文全文。