细胞凋亡的形态学观察
2.透射电子显微镜观察
3.荧光显微镜观察1)苏木精-伊红(He)染色:细胞核固缩断裂，蓝黑色，细胞质微红(凋亡细胞)，正常细胞核均匀并呈淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈极淡蓝色或蓝色并消失。
2)姬姆萨染色、瑞氏染色等。，显示正常细胞核颜色均匀，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色较浅或不着色。1)细胞体积变小，完全萎缩。
2)凋亡小体是细胞周围的几个圆形小体。凋亡细胞体积变小，集中在细胞质中。
凋亡过程中核染色质的形态变化可分为三个阶段:第一阶段，细胞核呈波纹状或折叠状，部分染色质浓缩；ⅱ a期细胞核染色质高度浓缩，边缘化；ⅱ b期细胞核碎裂成碎片，形成凋亡小体。常用荧光染料:吖啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258、Hoechst33342、EB等。
Hoechst 33342、Hoechst 33258和DAPI与DNA的结合是非嵌入的，主要在DNA的A-T碱基区。当被紫外光激发时，它会发出明亮的蓝色荧光。
1)PI双重染色法的基本原理
Hoechst是一种与DNA特异性结合的活性染料，可以进入正常细胞膜，对细胞没有很大的细胞毒性。凋亡细胞中Hoechst 33342的荧光强度高于正常细胞。
DAPI是半透性的，用于常规固定细胞的染色。
碘化丙锭(PI)是一种核酸染料，不能穿透完整的细胞膜，但在细胞凋亡和死亡的中后期，PI可以穿透细胞膜，将细胞核染成红色。因此，如果Annexin-V与PI匹配，可以区分早期和晚期凋亡细胞和死亡细胞。原理:脱氧核苷酸衍生物地高辛[(地高辛配基)-11-dutp]可在TdT酶的作用下掺入凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH端，与dATP形成杂聚物，可与报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)连接的抗地高辛抗体结合。在合适的底物存在下，过氧化物酶能产生强烈的显色反应，并能特异、准确地定位凋亡细胞，因此可在普通光学显微镜下观察。
洋地黄是地高辛的唯一来源。所有动物组织中几乎没有能与抗地高辛结合的配体，所以非特异性反应很低。地高辛特异性抗体与脊椎动物类固醇激素的交叉反应小于65438±0%。如果通过蛋白酶水解去除这种抗体的Fc部分，就可以完全排除Fc受体在细胞内的非特异性吸附。
该方法可用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片、冷冻切片以及培养或分离组织中细胞凋亡的测定。1，磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4): 50mM磷酸钠NaCl 200mM NaCl。
2.蛋白酶K(200μg/ml，pH7.4): 0.02g蛋白酶K；PBS 100毫升.
3.含2%H2O2的PBS缓冲液(pH 7.4):H2O 2 2.0ml；PBS缓冲液98.0毫升
4.TdT酶缓冲液(新鲜制剂):3.63g Trlzma碱用0.1N HCl调至pH 7.2，定容至1000ml；用ddH2O然后，加入29.96克二甲基砷酸钠和0.238克氯化钴。
5.TdT酶反应液:TdT酶32μl；76μl TdT酶缓冲液，混匀后置于冰上备用。
6.洗涤终止反应缓冲液:氯化钠17.4g；8.82g柠檬酸钠；ddH2O 1000毫升
7.0.05%二氨基联苯(DAB)溶液:DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4，使用前过滤，加双氧水至0.02%。
8.0.5%甲基绿(ph 4.0):0.5g；甲基绿；0.1M乙酸钠100ml。
9.100%丁醇、100%、95%、90%、80%、70%乙醇、二甲苯、10%中性甲醛溶液、醋酸、松香水等。
10，过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR) 1，样品预处理:
(1)石蜡包埋组织切片的预处理:将组织切片置于染色槽中，用二甲苯洗涤两次，每次5分钟。用无水乙醇洗涤两次，每次3min。用95%和75%的乙醇各清洗一次，每次3min。用PBS洗5分钟，加入蛋白酶K溶液(20ug/ml)，室温水解65438±5min，去除组织蛋白。用蒸馏水清洗4次，每次2分钟，然后按照下面的步骤2。
⑵冰冻组织切片预处理:将冰冻组织切片置于10%中性甲醛中，室温固定10min，然后去除多余液体。用PBS洗两次，每次5分钟。将其置于乙醇:乙酸(2: 1)溶液中5分钟，并在-20℃下处理5分钟以除去多余的液体。用PBS洗两次，每次5分钟，然后按照下面的步骤2。
⑶培养或分离细胞的预处理:约5 × 107个细胞/ml在4%中性甲醛中室温固定10min。将50 ~ 100μ l细胞悬液滴在载玻片上并干燥。用PBS洗两次，每次5分钟，然后按照下面的步骤2。
2.将含有2%过氧化氢的PBS加入到比色槽中，在室温下反应5min。用PBS洗两次，每次5分钟。
3.用滤纸小心吸干载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加入2滴TdT酶缓冲液，并在1 ~ 5min的室温下静置。
4.用滤纸小心吸干切片周围多余的液体，立即向切片中加入54μl TdT酶反应液，放入湿盒中37C反应65438±0hr(注意:阴性染色对照，加入不含TdT酶的反应液)。
5.将切片置于染色槽中，加入预热至37℃的洗涤和终止反应缓冲液，在37℃保温30分钟，每隔65438±00分钟轻轻提起和放下载玻片，轻微搅拌液体。
6.组织切片用PBS洗3次，每次5分钟后，直接向切片中加入两滴用过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，在湿箱中室温反应30分钟。
7.用PBS洗4次，每次5min。
8.将新鲜配制的0.05%DAB溶液直接加入组织切片，室温下显色3 ~ 6分钟。
9.用蒸馏水冲洗4次，前3次每次65438±0min，最后一次每次65438±0min。
10，室温下用甲基绿复染10分钟。用蒸馏水冲洗三遍，前两遍上下提拉载玻片10次，最后1次静置30s。用100%正丁醇以同样方式洗涤三次。
11.用二甲苯脱水3次，每次2分钟。密封干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。确保设置了阳性和阴性细胞质控品。对于阳性对照，可以使用被DNaseI部分降解的样品，对于阳性细胞对照，可以使用地塞米松(1μM)处理大鼠和小鼠的胸腺细胞或人外周血淋巴细胞3-4小时阴性对照不添加TdT酶，其他步骤同实验组。
在不可修复的DNA损伤后，细胞通常会经历程序性死亡或凋亡。但这种机制在肿瘤细胞中是无效的，所以可以随意增殖，拒绝接受“自杀”的命令。德国科学家发现了可能的原因——肿瘤细胞会降解一种可以引发细胞凋亡的蛋白质。抑制这种蛋白的降解可以恢复凋亡机制，增强放化疗的疗效。相关论文发表在《自然细胞生物学》上。
在严重的DNA损伤后触发凋亡的蛋白质之一是HIPK2分子。德国癌症研究中心的托马斯·霍夫曼(Thomas Hofmann)及其同事发现，HIPK2在健康细胞中不断产生，但一种名叫Siah-1的酶将其标记为“垃圾”，因此它立即被降解。
轻微受损的细胞会进入低水平警戒状态——短时间内抑制HIPK2的降解。一旦损伤被修复，细胞将立即恢复HIPK2的降解。只有在严重受损的细胞中(例如，两条DNA双链都被破坏)，HIPK2的降解才能被永久抑制。结果HIPK2不断积累，引发细胞凋亡和细胞自杀。
研究人员推测，这可能是放疗和化疗有时失败的原因。这两种治疗方法都会严重损伤肿瘤细胞，最终导致其程序性死亡。托马斯·霍夫曼(Thomas Hofmann)说:“如果有耐药性，往往是因为肿瘤细胞‘拒绝’执行自杀命令。”
研究人员在实验中抑制了Siah-1酶，发现即使在轻微损伤的细胞中，HIPK2也可以积累并触发凋亡。霍夫曼推测，“癌症医学很可能会利用这一发现。例如，我们可以使用Siah-1抑制剂结合放疗或化疗，将细胞拉回凋亡机制。