蛋白质研究泛素-蛋白酶体降解的基本思路(详解)
泛素有七个赖氨酸残基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)和一个蛋氨酸残基(M1)。泛素主要由赖氨酸残基和蛋氨酸残基连接。得到的泛素链具有一定的拓扑结构，蛋白质底物的功能可以通过修饰来确定。
将泛素加到底物蛋白上，称为蛋白的泛素化。蛋白质泛素化是一种动态的、多方面的翻译后修饰，几乎涉及真核生物的所有方面。泛素涉及激活、结合和连接三个主要步骤，分别由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2s)和泛素连接酶(E3s)完成。其中，人类E1有两种:UBA1和UBA6人类E2有35种；有数百个人类E3。
E3酶有两个结构域之一:HECT结构域和环状结构域。HECT结构域的E3连接酶首先结合泛素本身，然后将泛素转移到底物上，而环结构域的E3连接酶使E2酶直接将泛素转移到底物上。
HECT结构域E3通过两种机制连接泛素靶底物:首先泛素从E2的活性位点转移到E3活性位点的Cys，然后靶底物中的Lys残基被泛素化。相反，环和环相关结构域E3连接酶在一步中用作泛素化靶底物的支架:E2直接将泛素转移到靶底物中的Lys残基。
目前，E4酶仍然存在于人体内。E4酶是一种泛素链延伸因子，可以延伸单个泛素化底物的泛素链，形成多泛素化。
单泛素化是将泛素分子添加到底物蛋白残基上。多单泛素化是在多个底物残基上增加一个泛素分子。多泛素化是在底物蛋白的单个残基上形成普遍存在的蛋白链。目前泛素能结合的底物残基有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。
根据泛素与底物的连接位点，有M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63、G76等9种泛素化方法。不同的泛素化方式调节不同的功能。其中与蛋白酶体降解相关的泛素化为K48。
一项全面的蛋白质组学研究确定了数千种蛋白质中的数千个泛素化位点。大多数蛋白质会在它们细胞生命中的某个时刻经历泛素化。
蛋白质中泛素-蛋白酶体降解的研究主要是关于两种蛋白质之间的关系，即E3连接酶和底物蛋白。
环己酰亚胺，CHX)是细胞内蛋白质合成的抑制剂。MG132是蛋白酶体抑制剂。
在图3中，与MG132的未处理组相比，MG132处理组的底物蛋白在各个时间点没有明显变化，而MG132处理组的底物蛋白水平在2h、4h和8h有明显下降。说明底物的降解与蛋白酶体有关。
在图4中，随着E3泛素连接酶表达的增加，底物蛋白的表达水平相应降低。在图5中，随着E3泛素连接酶活性失活突变表达量的增加，底物蛋白的表达量没有明显变化。在图6中，E3泛素连接酶在细胞中的表达水平被E3泛素连接酶的siRNA敲低，底物蛋白的表达水平相应增加。在图7中，过表达E3泛素连接酶降低了底物蛋白的半衰期。在图8中，敲除E3泛素连接酶增加了底物蛋白的半衰期。这表明E3泛素连接酶可以降低底物蛋白的表达水平。
免疫沉淀用于检测两种蛋白之间的相互作用。大致分为以下三种类型:
通过文献或生物信息学分析E3泛素连接酶和底物蛋白的不同结构域。图15显示了E3泛素连接酶的不同结构域:结构域1、结构域2、结构域3、结构域4；图15是底物蛋白不同结构域的示意图:domaina、domainb、domainc和domaind。免疫沉淀用于检测两种蛋白质之间不同结构域的相互作用，如图16和图17所示。找到对应的结构域后，检测这两个结构域之间的相互作用，如图18和图19所示。
通常，通过外源表达的泛素分子来检测蛋白质的泛素化，也可以使用内源性泛素抗体。因为泛素化是泛素分子和底物蛋白之间的价键，SDS不能破坏这种相互作用，所以在图20中可以看到多泛素化链的存在。一个泛素分子约为8.5KD，所以IB结果中基于底物蛋白可能存在清晰的梯状带或涂抹带。
蛋白质泛素化是蛋白质的翻译后修饰，可以调节蛋白质的功能。目前泛素化类型有K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63，即泛素分子和蛋白* *的K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63。一般认为K48的泛素化可以被蛋白酶体识别。因此，有必要确认蛋白质的泛素链是K48链。泛素分子赖氨酸单位点突变(见图21)或泛素分子单一赖氨酸保留突变(见图23)，以及底物的蛋白泛素化类型通过免疫沉淀和蛋白质印迹进行检测，如图22和24所示。
通过过表达(图25)或敲低(图26)E3泛素连接酶来检测底物蛋白泛素化水平的变化。
体外泛素可以消除体内的复杂环境，使E3泛素连接酶直接与底物蛋白相互作用，使得E3泛素连接酶的泛素化底物蛋白更有说服力。体外UB、E1、E2、ATP、缓冲液都有市售试剂盒。我们只需要纯化E3泛素连接酶和底物蛋白进行体外泛素化反应，就可以检测底物蛋白的泛素化。