FLAER多参数检测对PNH克隆的影响
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，其发病机制主要是由于体细胞X染色体上的PIG-A基因发生突变，导致血细胞膜表面糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成紊乱，锚连接蛋白丢失。传统的诊断方法主要有蔗糖溶血试验、酸性溶血试验和劳斯试验，但这些方法的敏感性和特异性较差。近年来，流式细胞术检测CD55和CD59已成为诊断PNH的常规方法，尤其是CD59比CD55更敏感，被认为是诊断PNH的较好指标。灭活嗜水气单胞菌溶素前体(FLAER)的荧光标记变异体能特异性结合GPI锚定蛋白，其特异性和敏感性均优于流式细胞术的传统方法。PNH、再生障碍性贫血(AA)和骨髓增生异常综合征(MDS)均为骨髓衰竭性疾病，发病机制和临床表现相似，早期鉴别诊断往往比较困难。本文联合FLAER、CD45、CD15、CD24检测粒细胞PNH克隆，联合CD59检测红细胞PNH克隆，有效提高PNH克隆检测的敏感性和特异性，有助于骨髓衰竭疾病的早期鉴别诊断。报告如下。
1数据和方法
1.1一般资料所有病例均来自我院血液科连续住院患者48例。其中PNH患者9例，AA患者13例，诊断符合血液病诊断及疗效标准。共有11名MDS患者，符合2008年世卫组织诊断分类标准。对照组15例均为巨幼细胞性贫血患者。
1.2仪器和试剂FACSAria流式细胞仪、溶血素、磷酸盐缓冲液(PBS)和试剂CD59、CD45、CD15、CD24均购自BD公司，FLAER试剂购自加拿大Protox生物技术公司。
1.3方法
1.3.1检测外周血红细胞CD59取100μL EDTA抗凝全血，用PBS洗涤，用1.5ml PBS稀释，取100μL加入20μL CD59-PE单克隆抗体，4℃避光孵育30min。用2mL PBS溶液洗涤两次，重悬于1mL PBS溶液中，计算机检测。流式细胞仪检测CD59细胞的表达率。
1.3.2外周血粒细胞FLAER检测取100μL EDTA抗凝全血，分别加入20μL抗体CD45、CD15、CD24和FlAER，避光孵育30min，再加入2mL溶血素，室温避光10min，溶血完成后，65438。弃去上清液，用2mL PBS溶液洗涤两次，重新悬浮于500μL PBS溶液中进行液体机检测，流式细胞仪测定FLAER的表达率。
数据分析采用SPSS17.0软件，计量数据以X±s表示，组间比较采用T检验和Mann-Whitney U检验，P
2个结果
2.1临床特征PNH患者9例，其中男性6例，女性3例，年龄16 ~ 60岁，中位年龄30岁。共有13名AA患者，包括5名男性和8名女性，年龄从7岁到63岁，中位年龄为38岁。MDS患者11，男5，女6，年龄41 ~ 72岁，中位年龄53岁，包括RCMD 1，RCUD 6，RAEB-I 2，RAEB-II 1，5q综合征65438。对照组15例，其中男性6例，女性9例，年龄19 ~ 61岁，中位年龄34岁。
2.2 PNH患者不同检测方法比较，PNH患者FLAER和CD59缺失率分别为(70.07±28.77)%和(38.51.29.1.05)%，明显高于对照组、AA组和MDS组，差异有统计学意义(P
2.3不同方法检测非PNH患者的比较各组FLAER的平均缺失率均高于CD59，但差异无统计学意义(P & gt0.05)，表明非PNH组FLAER与CD59无显著差异。对照组FLAER缺失率为0.0%，特异性为100%。CD59缺失3例，缺失率均小于65438±0%。13例AA患者中有5例检出FLAER缺失，其中4例检出CD59缺失，1例未检出。11 MDS患者中有3例检出FLAER缺失，其中2例CD59缺失，1患者中CD59缺失率为0。结果表明FLAER比CD59更敏感和特异。
3讨论
迄今为止，已发现PNH患者血细胞表面有20多种蛋白质表达缺失，其中红细胞膜上衰变加速因子(CD55)和反应性溶血膜抑制因子(CD59)的缺失被认为是PNH病理生理的主要原因。红细胞数量多，抗体表达强，是灵敏度检测的最佳靶细胞。特别是在一些粒细胞减少症的疾病中，如AA和MDS，红细胞检测尤为重要。同时，通过比较红细胞和白细胞的数值，可以为临床提供更多的信息。红细胞上CD55分子表达量低，而CD59分子荧光染色强且均匀，近年来已成为PNH诊断的“金标准”。然而，越来越多的研究发现，检测红细胞CD59的表达对PNH的诊断有一定的局限性。
本研究发现，在PNH组的两名患者中，一名患者CD59的缺失率为5.5%，另一名患者为2.9%，而FLAER的缺失率分别为23.2%和47.7%。可能是因为患者处于疾病活动期，接受输血治疗，影响了红细胞CD59的表达，导致CD59表达假阳性。研究表明，在小细胞色素减退性贫血中，患者红细胞表面CD59的表达降低，但粒细胞正常。如果只检测红细胞上的CD59，其表达将是假阴性。此外，正常细胞在老化过程中，表面分子CD59可能会自发丢失，导致检测值与事实存在偏差。随着科技的不断发展，人们开发了FLAER技术。FLAER是Alexa-488标记的无活性嗜水气单胞菌溶素前体的变体，能特异性结合GPI锚链蛋白，特异性表达于所有具有GPI锚链蛋白的粒细胞上，不会因不同细胞表达的GPI锚链蛋白数量和类型不同而造成错误。因为FLAER可以直接检测GPI蛋白，所以有助于鉴别真正的PNH和免疫性血细胞减少，鉴别真正的GPI阴性细胞。本研究中对照组FLAER缺失率均为0，检测结果比CD59更具特异性。在PNH组中，FLAER的缺失率明显高于CD59，敏感性更高。FLAER也是防止污染细胞出现在门内的最佳抗体。如果少量. CD24阴性表达的细胞在门内被污染，可能会被误认为小PNH克隆。FLAER与CD24联合使用可提高PNH检测的准确性，CD24/FLAER双阴性细胞群才是真正的PNH克隆细胞群。FLAER多参数检测要求外周血标本采集后必须及时送检，否则会导致粒细胞存活率下降，细胞非特异性染色增强，影响检测效果。这在一定程度上影响了FLAER的临床应用。PNH克隆的检测对MDS和再障的临床表现、治疗和预后具有重要意义。部分有PNH克隆的AA患者免疫治疗效果较好，即使克隆小于0.1%，也会影响治疗效果。
对于PNH克隆数量较少的AA患者，有必要监测PNH克隆的变化，因为患者可能发生溶血性贫血。在这项研究中，PNH和MDS之间的关系仅限于低风险MDS，其特征是血细胞减少和低骨髓增生。基因异常发生率低，临床过程懒进，更多表现为骨髓衰竭。AA组和MDS组的FLAER缺失率高于CD59。因为很难区分AA和低增殖性MDS，所以迄今为止，还没有关于MDS患者进展为PNH的报道。监测PNH克隆对这两种疾病的鉴别有一定意义。在AA和MDS患者中检测到的PNH克隆通常非常小，并且CD59检测不容易检测到。两组患者均为1，CD59缺失率为0，而FLAER表达缺失，缺失率分别为4.2%和2.9%。FLAER检测比CD59更敏感。由于AA、发育不全MDS和PNH都是骨髓衰竭疾病，其发病机制、临床表现和生物学特征相似，因此很难区分。FLAER检测比CD59更敏感和特异。它可以在早期为PNH克隆提供更敏感和特异的基础。对于临床症状不典型、诊断不明确的疑似PNH患者，FLAER检测有助于早期诊断或排除。因此，FLAER对PNH克隆的高灵敏度检测，对这三种疾病的诊断和鉴别，对了解临床进程、预后和转归有一定的意义。
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