折叠房屋上的纸

[关键词]折叠识别与结合蛋白，生物大分子的分子伴侣

对生物大分子结构和功能的研究是在分子水平上理解图像的基础。不了解生物大分子的结构和功能，就没有分子生物学。就像没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传递的中心法则，就没有今天的分子生物学。结构分子可以从第一个分子进入到多亚基、多分子的复合体中。同时，随着研究的深入和技术手段的发展，过去难以研究的分子水平的生命运动也逐渐由难变热。蛋白质晶体学的研究已经从生物大分子的静态(时间统计)结构分析开始到动态(时间分辨)结构分析和动力学分析。第十三届国际生物物理学大会的25个专题讨论会中，有一半以上涉及蛋白质的结构与功能，“结构与功能”强调“动力学”，即蛋白质的动态结构或其运动与分子功能之间的关系，以及对大分子相互作用的贡献。

蛋白质折叠被列为“21世纪生物物理学”的重要课题，是分子生物学中心原理尚未解决的重大生物学问题。从蛋白质分子的一级序列预测其三级结构，进而预测其功能是一项非常具有挑战性的工作。蛋白质折叠的研究，尤其是早期折叠过程，即新生肽的折叠过程，是全面并最终阐明中心原理的根本问题。在这一领域，近年来的新发现从根本上修正了新生肽可以自发折叠的传统观念。其中，X射线晶体衍射、各种光谱技术和电子显微镜技术发挥了极其重要的作用。在第13届国际生物物理学大会上，诺贝尔奖获得者恩斯特在报告中强调，核磁共振研究蛋白质的一个主要优势是可以非常详细地研究蛋白质分子的动力学，即蛋白质分子的动态结构或结构的运动与功能之间的关系。目前核磁共振技术已经可以在时间域内观察到蛋白质结构从秒到皮秒的运动过程，包括主链和侧链的运动，以及蛋白质在各种温度和压力下的折叠和去折叠过程。蛋白质大分子的结构分析，不仅仅是解决一个具体的结构，更多的是关注结构的波动和运动。例如，运输小分子和蛋白质的酶通常以两种构象存在，配体结合和配体非结合。一个构象中的结构涨落是构象转变的必要前奏，因此需要结合光谱学、光谱学和X射线结构分析来研究结构涨落的平衡、构象变化以及变化过程中形成的各种中间态。再比如，为了理解蛋白质是如何折叠的，需要知道折叠过程中几个基本过程的时间尺度和机制，包括二级结构的形成(螺旋和折叠)、卷曲、长程相互作用和未折叠肽的完全折叠。多种技术用于研究次级过程，例如快速核磁共振和快速光谱技术(荧光、远紫外和近紫外圆二色性)。

1.新生肽折叠研究的新观点。

长期以来，蛋白质折叠形成了自组装的主导理论。因此，在研究新生肽的折叠时，很自然地把体外研究蛋白质折叠时得到的规律推广到身体上，用变性蛋白质的复性作为新生肽的折叠模型。人们认为，细胞中新合成的多肽链应该能够在没有其他分子和额外能量的帮助下自发折叠并形成其功能状态。

在1988中，邹承鲁明确指出新肽的折叠开始于合成的早期，而不是合成之后。随着肽的延伸，同时折叠，构象不断调整。首先形成的结构将影响后来合成的肽的折叠，然后合成的结构将影响先前形成的结构的调整。所以肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同步协调的动态过程。在20世纪90年代，发现了一类具有新生物学功能的蛋白质，分子壳蛋白，以及在更广泛的意义上，帮助蛋白质折叠的辅助蛋白的出现，表明细胞中新肽的折叠通常需要帮助，而不是自发的。

第二，蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用

蛋白质分子的三维结构除了* * *价肽键和二硫键外，还依赖于大量极其复杂的弱二级键。因此，在合成和折叠的过程中，新的肽段可能会暂时形成最终成熟蛋白质中不存在的结构。它们往往是疏水表面，很可能由于不应该存在的错误相互作用而形成非功能性分子，甚至引起分子聚集和沉淀。根据自组装理论，折叠的每一步都是正确的、充分的、必要的。折叠过程其实就是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程。为了提高蛋白质生物合成的效率，应该有一个竞争机制来帮助正确的途径，分子伴侣通过进化应运而生。它们的功能是识别新肽折叠过程中暂时暴露的错误结构，并与之结合生成复合物，从而防止这些表面之间过早的相互作用，防止不正确的无功能折叠路径，抑制不可逆聚合物的生成，这必然会促进折叠向正确的方向发展。(从哲学的角度来看，反驳自组装理论似乎很容易，它违背了矛盾的普遍原理。试想，如果蛋白质折叠的每一步都是正确的、充分的、必要的，那岂不是毫无矛盾地完成了复杂的最稳定构象的形成，也就是从量变到质变，从无活性的肽链到有活性的功能蛋白质的巨大飞跃，这显然违背了哲学的基本原理。换个角度看，生物进化的过程充满了无方向性的变异，有些是适应环境的，有些不是。“自然选择”淘汰不适应的，保留适应的。蛋白质分子的折叠不也是类似的吗？我认为蛋白质的一级结构只是肽链折叠并形成功能蛋白质特定三维结构的内因。事实上，在形成活性蛋白质的每一步，多肽链都可能潜在地形成“不正确”的折叠。如果没有分子伴侣或其他辅助蛋白等外部因素的作用，多肽链永远不会折叠成活性蛋白。)

第三，分子伴侣的机制

分子伴侣的机制实际上是它如何识别、结合和解离目标蛋白的机制。有些分子伴侣具有高度的特异性，如一些分子内分子伴侣，假单胞菌酯酶有自己的“私人分子伴侣”。它由limA基因编码，与酯酶基因LipA只有3个碱基的距离，可能是进化过程中基因分裂造成的。然而，一般分子伴侣识别特异性不高。它如何识别需要它帮助的对象？现在只能说分子伴侣识别非自然构象，忽略自然构象。在天然分子中，疏水残基大多位于分子内部形成疏水核心，可能在解折叠后暴露出来，或者在新生肽折叠过程中临时形成天然构象中分子内部本应存在的疏水表面，因此认为分子伴侣最有可能与疏水表面结合，如罗丹类分子α-螺旋的疏水侧。但只有具有β-折叠结构的蛋白质才能被分子伴侣识别。

最近，在识别机制方面取得了很大进展。Bip是内质网腔内的分子伴侣。通过亲和淘选法检测Bip与具有随机序列的十二肽结合的特异性。结果表明，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hy基序与Bipj结合最强，Hy最多的是Trp、Leu和Phe，它们都是较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够结合了。还有一种比较常见的说法是分子伴侣认可所谓的moltenglobule结构。另一方面，分子伴侣本身与肽结合位点的结构分析最近也取得了一些进展。例如，PapD的晶体结构显示该多肽与其β-折叠区结合。在GroEL中，约40kD的153-531结构域是核苷酸的结合区。

分子伴侣的第二步是与靶蛋白形成复合物。一个非常流行的模型认为分子伴侣通常以聚体的形式形成一个中心空腔结构。通过电子显微镜观察到，由两个甜甜圈组成的十四个GroEL分子和由一个甜甜圈组成的七个GroES分子合作形成一个中空的不对称cagemodel，推测目的蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔中进一步折叠而不受干扰。然而不久前，日本的一个实验室发现，GroEL的一个亚基，即使是N端去掉78个氨基酸残基的50kD片段，也无法再组装成一个四分体结构，并且都具有明确的分子伴侣功能。因此，我认为:也许并不是环状分子伴侣的每一部分都是有效的结合位点，也就是说，由两层甜甜圈组成的四分体GroEL分子中，只有一个或几个部分可以与疏水残基或所谓的熔球结构结合，其余部分则起识别作用。就像探测器一样，整个四分体GroEL分子以环状或笼状结构“包裹”在多肽链的主链中。它通过进动在多肽链的链上移动。一旦在环状聚合物的某个识别部分发现疏水结构或所谓的融合球结构，信号转导后聚合物的结合部分就会与之结合形成复合物，抑制不正确折叠。以上完全是我个人的猜测，我尝试基于以上两个实验现象的矛盾来解释。假设多肽链以进动方式运动，我没有任何依据，但我认为应该是一个动态过程，所以做了一些冒昧的假设。另外，我觉得也许可以用X射线衍射来检测分子伴侣GroEL和GroES组成的笼状结构，看看它的a×b×c是否足以容纳多肽链的某一段，或者它的内外疏水性质和其他物理化学性质如何，也许可以找到支持或者反驳上面的。

以上都是蛋白质的分子伴侣。不久前，出现了一个新名词“DNA倍体”(DNAchaperones)，DNA分子伴侣与DNA结合并帮助其折叠。在这种复合体中，DNA分子被包围在蛋白质分子的表面，高度有序，结构发生了一定程度的变化。DNA和蛋白质之间的这种相互作用对于DNA转录、复制和重组非常重要。或者像核小体一样，DNA的包装是必要的。DNA在溶液中的结构是相当刚性的，它必须克服一个能量障碍才能转化为其蛋白质复合物的结构。分子伴侣的作用是帮助DNA分子折叠和扭曲，从而将DNA稳定在适合蛋白质结构的特定构型。这种结合是协同的，并且在复合物形成后可逆地解离。因此，DNA分子伴侣和蛋白质分子伴侣都与DNA和蛋白质之间的相互作用以及基因调控有关。看来，分子伴侣确实与最终阐明中心法则的主要问题密切相关。

第四，分子伴侣和酶的区别

与分子伴侣不同，帮助蛋白质折叠的酶只有两种。一种是蛋白二硫异构酶(PDI)。另一种是肽基脯氨酸顺反异构酶(PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二硫键与新生肽的折叠密切相关，对维持蛋白质分子的结构稳定性和功能也有重要作用。PDI位于内质网腔内，内容丰富，催化蛋白质分子中巯基与二硫键的交换反应。同时，它是目前发现的最突出的多功能蛋白质。除了二硫键异构酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚单位。也是微粒中甘油三酯转运蛋白复合物的小亚单位，也是糖基化位点结合蛋白。其中，最引人注目的是它具有结合不同序列、长度和电荷分布的肽的能力，特异性较低，主要与肽主链相互作用，但对巯基仍有一定的偏好性。根据分子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两种不同的辅助蛋白，但中国上海生物物理研究所最近提出了不同的观点，认为蛋白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。

蛋白质分子中天然二硫键的形成，需要这些在肽链上往往不相邻的巯基先将肽链折叠到一定程度，才能相互靠近正确形成二硫键。肽链的自我折叠是一个缓慢的过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质中天然二硫键的形成是一个快速的过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异性结合各种肽链的能力，以非常高的浓度存在于内质网中，是一种钙结合蛋白，可以磷酸化，已经符合分子伴侣的要求。因此，他们推测蛋白质二硫键异构酶可能首先阻止错误的折叠途径，促进正确中间体的形成，帮助肽链折叠为相应的巯基配对，从而形成正确的二硫键。然后催化巯基氧化或二硫键异构化形成天然二硫键。他们认为蛋白质二硫键异构酶的酶活性与其分子伴侣功能并不相互排斥，而是密切相关、相互协调的。分子伴侣和帮助新生肽链折叠的酶之间不应该也不可能有绝对的分界线。我认为:酶最重要的特性是催化生化反应，分子伴侣的主要作用是与新肽的错误构象结合，从而阻止肽链不正确的非功能性折叠路径，促进其向正确的折叠方向反应。这不能理解为间接催化肽链折叠吗？显然，抑制不正确的折叠途径相当于加速正确的反应。所以，我个人很赞同他们的观点。最近的实验为这一假设提供了很好的证据。PDI能明显抑制变性甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性过程中的严重聚合，有效提高其复性效率，这与典型的分子伴侣GroE系统对甘油醛-3-磷酸脱氢酶复性的作用非常相似。

动词 （verb的缩写）分子伴侣的结构

目前唯一能解决晶体结构的分子伴侣是大肠杆菌的PapD，它帮助鞭毛蛋白折叠。还有HSP70的n端结构域，也就是ATP结合结构域，也有晶体结构。通过电子显微镜已经清楚地看到GroEL的四聚体和七聚体的四方结构，就像两个圆形的空心面包圈叠在一起。核磁共振和各种溶液的构象变化是研究分子伴侣作用机制的有效手段。

第六，分子伴侣研究的实际应用

分子伴侣的研究成果一定会加深我们对生命现象的理解，同时也一定会增加我们对抗自然的能力和生存的能力。因为分子伴侣在生命活动的各个层面都起着重要的作用，它的突变和损伤必然会引起疾病，所以我们可以期待利用分子伴侣的知识来治疗所谓的“分子伴侣疾病”。另一方面，利用分子伴侣的研究成果，从根本上提高基因工程和蛋白质工程的成功率，也将对大大提高人类生活水平发挥重要作用。

[参考书目]

1.李宝健主编，面向21世纪生命科学发展前沿，广东科学技术出版社，1996 11第一版:93-104页。

2.郝季星主编，理论物理与生命科学，上海科学技术出版社，第一版，1997，12: 29-58页。

3.中国生物物理代表团，从第十三届国际生物物理大会看生物物理研究的现状和趋势，生物物理学报，第15卷第4期，1999: 826-827。