电动婴儿摇篮的纸质设计

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解决方案:

(1)转移缓冲液:称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris碱、0.37 SDS和200ml甲醇，加去离子水至1000ml，蛋白质分子量小不加SDS。

(2) PBS-T: NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4？12H2O 2.9g，溶于800ml去离子水中，用盐酸调节PH至7.4，最后溶解至1000ml，加入0.05%Tween20。

(3)封闭液:将5%脱脂牛奶溶于PBS中。

(4)氨基黑染料溶液:将0.2%氨基黑溶于7%乙酸中。

(5)氨基黑脱色溶液:30%甲醇，10%冰醋酸溶液。

SDS-PAGE相关解决方案

(1).电极缓冲液:

三:6克

甘氨酸:28.8克

(10%)十二烷基硫酸钠:10毫升

加入1000毫升H2O，pH值为8.3。

(2).分离胶缓冲液:100ml:

三:36.6克

1N盐酸:(约48毫升):PH值:8.9

加水至:100毫升。

(3).浓缩橡胶缓冲液:100ml；

三:5.98克

1N HCL:(约48ml): PH:

加水至:100毫升。

(4).凝胶储存溶液:100毫升:

ACR:30克

双:0.8克

加水至:100毫升。

(5).4x装载缓冲器:

2-Me: 20% 2ml

十二烷基硫酸钠:8% 0.8克

甘油:40% 4毫升

溴酚蓝:0.4% 0.04克

Tris-CL (ph6.8) 240mM 2.5ml(浓缩凝胶缓冲液)

加入1.5毫升H2O。

总计:10毫升

(6)染色液(快速染色配方，染色1小时)

0.1%考马斯蓝，10%乙酸，45%甲醇

考马斯蓝R-250 1g

甲醇450毫升

水450毫升

冰醋酸100毫升

(7).脱色液:1000ml。

冰醋酸:75毫升

甲醇:50毫升

水:875毫升

细胞裂解物

(1)缓冲液A:25mM Tris pH 7.5

50毫米KCl

2毫米氯化镁

1毫米EDTA

5 mM二硫苏糖醇(DTT)

(2)核裂解物

缓冲NE:

25毫米Tris pH 7,5

0.42 M氯化钠

1.5毫米氯化镁

0.5毫米EDTA

1 mM二硫苏糖醇(DTT)

25%蔗糖

0.2% SDS(未添加免疫沉淀)

细胞裂解前加入蛋白酶抑制剂，最终浓度为100 mg？PMSF，1毫克？L-1抑肽酶，2 mg？L-1亮肽素

步骤:SDS-PAGE电泳。

按照配胶方法配制不同浓度的PAGE胶，通过电泳将染料置于分离胶底部，切断电源。取下凝胶，

蛋白质印迹

1.电泳结束后，用要转移的蛋白泳道切下凝胶，在右下角做个记号，确定方向和正反面。

2.剪下1片与凝胶大小相同(不大于凝胶)的NC膜，在右下角标记，在转移缓冲液中浸泡5分钟左右。

3.剪下8张新华1滤纸，在右下角做个记号，与凝胶大小略相同(不大于凝胶)。

4.将切好的滤纸浸泡在转移缓冲液中，从阳极到阴极(从下到上)依次安装转移装置:将底电极放平，将四张浸泡过的滤纸放在底电极上，准确对齐，将NC膜放在滤纸上，消除气泡。将SDS-PAGE凝胶转移到转移缓冲液中，冲洗，平铺在NC膜上，用玻璃棒挤出所有气泡。将4张浸湿的滤纸放在上面，排出气泡。

5.将上电极放在夹层上，接通电源，按凝胶面积1mA/cm2接通电源，通电2 ~ 4小时。100毫安，2小时.

6.转移后，取出滤纸。将凝胶转移到考马斯亮蓝染料盘中，检查蛋白质转移是否完成。剪下含有分子量标准的NC膜，放入氨基黑染料溶液中30秒，氨基黑脱色液脱色。

7.用蒸馏水将蛋白转移后的NC膜略洗并略干，然后浸泡在4℃的封闭液中密封过夜，再用PBS-T缓冲液洗膜三次，每次65438±00min。

8.将膜与第一抗体在室温下孵育2小时，用不同稀释度的PBS-T缓冲液稀释第一抗体，找到最适合的第一抗体浓度，然后用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。

9.将膜与HRP标记的羊抗鼠IgG (1: 5000) * *孵育1h，用PBS-T缓冲液洗膜三次，每次10min。

10.制备发光基质(按照1: 1混合基质液)。

用11洗完。PBS-T缓冲液，在化学发光底物上显色2分钟，凝胶成像系统观察并拍照。(或在DAB显色液中于暗处显色0 ~15分钟，出现条带中断显色反应后立即用水冲洗)。

我只是举个例子，因为只有你想出来的实验才是得心应手的。如果有人教你做实验，你的想法会跟着别人走，可能会被别人误导。做这个实验有什么意义？