如何分析真菌基因克隆后的调控

玉米大斑病的防治一直是玉米生产中的重要问题，了解其致病过程是控制玉米大斑病危害的重要前提。玉米叶枯病菌的致病过程是玉米叶枯病菌与寄主玉米相互识别和相互作用的过程。研究这一特定互作过程中的信号转导机制，对于深入了解玉米叶枯病菌的致病机理、设计新的杀菌剂和提出新的植物病害防治策略具有重要意义。本文研究了Ca2+信号转导途径对玉米叶枯病分生孢子形态结构和致病性的调控。本文利用Ca2+信号转导通路的特异性抑制剂，确定了Ca2+信号转导通路与玉米叶枯病孢子萌发、附着胞形成和致病性的关系。发现钙调素抑制剂TFP和钙调素磷酸酶抑制剂CsA对分生孢子萌发和附着胞形成的抑制作用随着浓度的增加而明显增强。在相同浓度下，抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发，抑制剂能使附着胞明显变小甚至不能形成。上述结果表明，钙信号转导途径参与了疏水条件下玉米叶枯病孢子萌发和附着胞形成的调控。根据钙调素氨基酸序列保守区设计简并引物，通过PCR技术获得钙调素基因同源片段，通过SMART-RACE技术获得钙调素全长cDNA序列。根据CaM基因的全长cDNA序列，设计基因特异性引物扩增玉米灰斑病菌基因组DNA，获得了该基因的全长DNA。BLASTX软件与GenBank中已知蛋白的同源性分析表明，开放阅读框编码的氨基酸序列与许多真菌的钙调素基因相似度为95% ~ 100%，如稻瘟菌(Cochliobolus miyabenus)、小麦纹枯病(Phaeosphaeria nodorum)和稻瘟病菌。因此，初步推测该序列为玉米灰斑病菌的钙调素基因CaM，获得的cDNA序列已提交GenBank(登录号:EF010936)。水稻白叶枯病菌CaM基因的DNA和cDNA全长。maydis为776 BP和450 bp，编码149个氨基酸，有4个内含子。实验中发现的所有内含子都符合GT-AG规则。通过基因组步移技术获得CaM基因的启动子序列，用Proscan online软件对启动子序列进行分析。发现启动子序列含有几个与转录调控相关的保守序列(如TATA-box、Sp1、AP-2和TFIID)。Southern杂交结果表明，野油菜黄单胞菌CaM基因在基因组中以单拷贝形式存在。为了研究钙调素基因对玉米大斑病菌致病性的调控作用，构建了玉米大斑病菌反义诱导表达载体，并通过酶切验证了其正确性。利用PEG介导的转化系统，将构建的含有潮霉素抗性筛选标记的反义表达载体转化玉米灰斑病菌原生质体，获得14抗性转化子，该转化子可在潮霉素抗性平板上连续继代培养。利用设计的基因特异性引物和分子杂交技术，获得了两个CaM基因反义表达突变体。在奎尼酸诱导条件下，玉米灰斑病菌CaM基因反义表达突变体的分生孢子萌发率下降，分生孢子萌发后形成的附着细胞大多变形，黑色素沉积减少，提取的HT-毒素对感病寄主叶片的毒性显著降低。用候选基因法克隆了钙调素A亚基和钙调素下游的钙调素依赖性蛋白激酶基因。钙调神经磷酸酶A亚单位编码525个氨基酸。编码的氨基酸序列与GenBank中已知蛋白的同源性分析表明，编码的氨基酸序列与多种真菌如核盘菌、核盘菌和灰葡萄孢的钙调神经磷酸酶基因的相似性为860% ~ 94%。因此，初步推测该序列为玉米灰斑病菌的钙调神经磷酸酶基因CNA，获得的cDNA序列已提交GenBank，登录号为(EF407562)。该基因包含6个内含子，分别为116bp、47bp、47bp、47bp、47bp和49bp。玉米大斑病中有四种不同亚型的钙调素依赖性蛋白激酶。通过RACE技术已经克隆了三个钙调素依赖性蛋白激酶，第四个只得到部分片段。获得的cDNA序列已提交给GenBank，登录号为(EU605885，EU605886，EU605887)。钙调蛋白依赖性蛋白激酶的四种不同亚型都含有ATP结合位点和活性位点保守基序。信号转导途径在玉米叶枯病孢子形态和致病性的构建中起着重要作用。钙调素基因的抑制剂实验和反义抑制实验表明，钙调素基因对玉米叶枯病正常附着胞的形成有重要作用，钙调素还调节毒素的合成。钙调蛋白依赖性磷酸酶和激酶基因是玉米叶枯病钙信号转导途径的重要组成部分，它们的克隆为进一步了解玉米叶枯病钙信号途径奠定了基础。