关于细胞生物学实验的问题！！！！

现实生活中

1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的使用。

经验原则

分离细胞器的常用方法是将组织匀浆，悬浮在等渗介质中进行差速离心。叶绿体分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以避免渗透压变化引起的叶绿体损伤。以1000转/分钟的速度离心匀浆2分钟，以去除组织残留物和完整的细胞。然后以3000r/5min离心5分钟，即可得到沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程优选在0~5℃进行；如果是在室温下，要迅速分离观察。

使用荧光显微镜检测荧光物质时，会受到温度、光线、淬灭剂等多种因素的影响。所以在荧光观察中要抓紧时间，必要时立即拍照。另外，制作荧光显微标本时，最好使用非荧光载玻片、盖片和非荧光油。

实用测试产品

一.设备

1.主要设备:通用离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。

2.小型设备:2个500ml烧杯、1个250ml量筒、20个滴管、20个带10ml刻度的离心管、5个测试架、若干纱布、4个非荧光载玻片和4个盖。

第二，材料是新鲜菠菜。

三、试剂0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。

经验处方法

1.叶绿体的分离和观察

1.选择新鲜的嫩菠菜叶子，清洗并干燥，去除茎和脉，在150ml NaCl溶液中称取30g，放入组织捣碎器中。

2.用组织捣碎器低速(5000转/分)匀浆3 ~ 5分钟。

3.在500毫升烧杯中用6层纱布过滤匀浆。

4.取4毫升滤液，以1000转/分钟离心2分钟。丢弃沉淀物。

5.将上清液以3000转/分钟离心5min。弃去上清液，沉淀叶绿体(混有部分细胞核)。

6.用0.35摩尔/毫升溶液悬浮沉淀物，

7.取一滴叶绿体悬液在载玻片上，加盖玻片，在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察。

(1)在普通光学显微镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。

(3)荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光:将一滴叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，加入一滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上载玻片，在荧光显微镜下观察。

2.菠菜叶片的手工切片观察

用剃须刀片将新鲜嫩菠菜叶切成斜面，放在载玻片上，滴1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，盖上切片，轻压，显微镜下观察。

(1)在普通光学显微镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。

(3)间接荧光的观察:在手切片上滴1 ~ 2滴0.05438+0%吖啶橙染料溶液，染色1min，洗去残留溶液，盖上切片后在荧光显微镜下观察间接荧光。

真正的果实

1.叶绿体的分离和观察

1.在普通光学显微镜下，我们可以看到叶绿体呈绿色橄榄状，在高倍显微镜下，我们可以看到叶绿体内含有深绿色的颗粒，即基底颗粒。

2.以奥林巴斯荧光显微镜为例，在用B(蓝色)激发滤光片，用B分色镜，用O530(橙色)破滤光片的条件下，叶绿体发出火红的荧光。

3.吖啶橙染色后，叶绿体可以发出橙红色荧光，而其中的一些细胞核发出绿色荧光。

2.菠菜叶片的手工切片观察

1.普通光镜下可见三种细胞(1)的表皮细胞:边缘锯齿状的鳞状细胞；(2)保卫细胞:成对的肾形细胞，构成气孔；(3)叶肉细胞是长椭圆形细胞，呈网格状排列。叶绿体呈绿色橄榄形，高倍镜下可见绿色基粒。

2.在荧光显微镜下，叶绿体发出火红的荧光，但其荧光强度比游离叶绿体弱，气孔发出绿色荧光，两个保卫细胞中火红的叶绿体围绕气孔呈一圈排列。表皮细胞中的叶绿体数目比叶肉细胞中的少

3.吖啶橙染色后，叶绿体发出橙红色荧光，细胞核发出绿色荧光，气孔保持绿色。

左烨

1.在普通光学显微镜下，用目测千分尺和台式千分尺测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。

2.在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤光片系统，叶绿体的颜色有变化吗？

实验五:植物染色体标本的制备和观察

实验目的

学习植物染色体标本的制备技术，了解富尔根反应的基本原理，学习其操作方法和压片方法，初步掌握细胞分裂各阶段的主要特征。

核酸是生物体最重要的组成部分。核酸可分为两类，即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。它们在细胞中的分布和化学性质是不同的。DNA在有丝分裂时主要分布在染色质或染色体中。RNA分布在细胞质和核仁中。但染色质和染色体中也含有少量RNA，核仁中也含有少量DNA。除了RNA，还有线粒体、叶绿体等细胞器。

实验原理

富尔根反应的原理是DNA被弱酸(1mol/L)水解后，嘌呤和脱氧核糖之间的键被打开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。这些醛基与希夫试剂原位结合形成含醌基()的化合物，醛基是发色团，所以有颜色，所以凡是有DNA的地方，都呈现紫红色。

实验材料

大麦、黑麦或小麦种子

实验内容

植物染色体标本的制备和DNA显示方法——富尔根反应

压片法

细胞有丝分裂期的观察

实验步骤

(1)植物染色体标本的制备

1.将植物种子放在湿润的滤纸上，20℃发芽，当胚根长到1 ~ 2 cm时，剪去0.5cm长的根尖部分。

2.预处理:将切下的根尖浸入0.1%秋水仙碱溶液中，在室温下处理3-4小时。

3.固色、水解和染色:

迷彩固定剂

固定为10-30分钟？95%酒精10分钟？70%酒精10分钟？蒸馏水→(对照)5%三氯乙酸？90摄氏度15分钟

1mol/L HCl ←蒸馏水？1mol/L HCl？60 oC 8分钟？希夫试剂40 -60分钟？亚硫酸盐水(1，2，3)？三次换自来水5分钟？将染色后的根尖冲洗干净，挂染色效果好的材料？蒸馏水？平板？显微镜观察

(二)压片法

压片的操作步骤如下:将根尖放在载玻片上，用刀片切下根尖(0.3cm)，将根尖纵向切开，加入一滴水，用解剖针将根尖纵向分成若干条，保留1-2条，加入盖玻片，用铅笔头轻轻敲击盖玻片，使细胞分离，展平成云状。

(3)蚕豆(或洋葱)根尖片的观察。

首先，在低倍显微镜下，区分根尖分生组织区和伸长组织区的细胞。然后在高倍显微镜下，观察细胞核的形态，注意你的片子上是否有有丝分裂细胞。如果有，你可以找出细胞分裂的几个阶段及其特征(见附录)

做富尔根反应时应注意的几个问题

固定液的选择:通常使用卡诺伊固定液。可以使用其他固定剂，如弗莱明固定剂和Champy固定剂，但不能使用Bouin固定剂。

水解时间:水解时间一定要合适，不能过长或不足，否则会影响实验结果。对于用卡诺伊固定液固定的材料，水解时间一般在8-65438±05分钟之间。水解时间的长短取决于不同的材料和不同的固定剂。

希夫试剂的质量:在进行富尔根反应时，重要的因素是希夫试剂的质量。实验时要注意试剂的颜色是否正常，是否有SO2的气味。

洗涤剂的重要性:漂洗时，每次实验前最好临时配制亚硫酸水，以保持SO2的浓度。

实验对照组:一定要做出正确的照片来说明实验结果的真实性。

术中用镊子取根尖生长区，不要夹住根冠。

在鸦片期间，根分生组织细胞应保持其原来的分布。

运用

简述富尔根反应的原理。

制作好的富尔根反应膜过程中需要注意什么？

画一个细胞分裂图。

实验6植物原生质体的制备

实验目的

1.学习植物原生质体的分离和制备技术，观察原生质体的形态。

2.学习植物原生质体融合技术，观察不同方法融合细胞的形态和变化。

实验用品

显微镜、镜面清洁纸、剪刀、镊子、小碟子、四根吸管、直漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片和盖。

实验原理

原生质体这个术语最早是由Hanstein在1880中提出的。具体来说，食用菌的原生质体是指细胞壁完全消除后残留下来的裸露的细胞结构。

植物的花瓣细胞用纤维素酶和离子分解酶处理后，纤维素和果胶成分被破坏，使原生质体离开细胞壁进入培养基。

植物花瓣细胞的液泡中有大量的色素，不同的细胞色素是不同的，所以我们可以通过颜色范围识别不同细胞的原生质体，以及同源细胞和异质细胞之间的融合，而不需要对细胞进行染色。

PEG是一种高分子化合物，因其醚键而具有负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极性基团形成氢键。当PEG分子足够长时，它可以作为相邻原生质体表面之间的分子桥梁，使它们粘附。PEG还可以连接Ca2+和其他阳离子。Ca2+可以在一些负极性基团和PEG之间形成桥梁，从而促进粘附。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子会被洗脱下来，这会引起电荷的无序和重新分布，从而引起原生质体融合。高Ca2+和高pH值的洗涤会增加质膜的流动性，从而大大提高融合频率。洗涤过程中的渗透压休克也可能在融合中起作用。

实验试剂

1.洗涤液:

甘露醇0.6 M

CaCl2？2H2O 8毫米

NaH2PO4？H2O 2毫米

Ph 5.6

实验步骤

1.酶溶液的制备将纤维素酶(EAS-867)溶于0.5 ~ 0.7 mol/L甘露醇中，加入10 mmol/L氯化钙溶液作为稳定剂。酶溶解后，通过4000 rpm的离心机沉淀原生质体，20分钟后，取上清液。酶液经注射器过滤器过滤后，再经0.45微米微孔滤膜过滤，分装于无菌箱中的三角瓶中，冰箱保存备用。

2.材料:从中部取苗龄60天以上生长在温室中的烟草植株，在阳光下照射2小时，使其枯萎。也可以用大棚种植的豆叶做同样的处理，或者用地里收获的胡萝卜，放在0℃以上的低温下备用。萎蔫叶片用3%漂白浓缩液浸泡15 ~ 20分钟，然后用无菌水冲洗，用无菌吸水纸吸干表面水分。

3.酶解用尖头镊子撕下叶子的下表皮，切成小块。胡萝卜用刀片切掉表皮和中柱，取皮层切成小块。将65438±0g上述材料放入含有65438±00ml酶溶液的培养皿中，并盖上盖子。保持温度在28 ~ 30℃1.5 ~ 3小时。

4.洗净叶片或其他组织后，会出现圆形游离原生质体，原生质体悬液中有未消化的组织、碎片、细胞和破碎的原生质体。用滤纸或尼龙布过滤粗杂质，然后将原生质体悬液移至离心管中，用手摇离心机旋转2分钟，吸去上清液(见图)，再加入0.5 ml甘露醇洗涤2 ~ 3次，最后得到相对纯净的原生质体，可用于进一步培养或其他实验。

实验7细胞融合方法

实验目的

1，初步掌握动物细胞PEG融合的方法。

2.了解细胞融合及其应用。

实验原理

两个或两个以上细胞融合成1细胞的现象称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合法。

用PEG处理细胞可以改变质膜的性质，导致细胞膜融合，细胞质循环，最终导致细胞融合。

实验设备、材料和试剂

1，仪器:

光学显微镜、离心机、恒温水浴锅、CO2培养箱、超净台、倒置显微镜等。

2.材料

新鲜鸡红细胞、无菌注射器、6号针、带刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片。

3.试剂

50%聚乙二醇，汉克斯溶液，甲醇，吉姆萨染料溶液，碘，75%乙醇。

实验法

(1)新鲜鸡血用0.85%生理盐水制成10%悬液。

(2)称取0.5g PEG(MW = 4000)，置于试管中，在酒精灯上熔化，迅速加入0.5ml预热的Hanks溶液，制成50% PEG溶液。放入37℃的水浴中待用。

(3)将1毫升上述10%鸡红细胞悬液置于离心管中，加入5毫升Hanks溶液混匀，然后以1，000转/分钟离心5分钟，小心弃去上清液，用手指弹法将细胞团打散。

(4)取上述50% PEG溶液0.5ml，在65438±0分钟内滴入鸡红细胞悬液中，边加边轻轻摇动。加入所有PEG后，静置约65438±0分钟。这整个过程要求在37℃的水浴中进行。

(5)缓慢滴加9ml Hanks溶液以终止PEG的作用，并在37℃水浴中静置5分钟。

(6)离心并弃去上清液后，取一滴融合细胞悬液，盖上盖子进行显微镜检查。