稻草纤维素发酵生产燃料乙醇的研究。
稻草纤维素发酵转化燃料乙醇的研究
摘要
我国稻草资源丰富，年产量超过3亿吨。用稻草生产燃料乙醇，对吗
中国未来在能源问题、节粮代粮和环境保护方面有着巨大的潜力和广阔的应用前景。稻草
主要成分是纤维素，纤维素利用最重要的限制因素是将纤维素转化为可发酵的纤维素。
解决这个问题的途径主要有两个:(l)提高纤维素酶生产的经济性，主要涉及纤维素酶含量高。
获得纤维素酶生产技术，提高其合成效率以降低单位纤维素酶生产成本；(2)提及
蛋白酶的利用效率主要涉及纤维素酶水解催化的过程，以降低单位可发酵还原糖的生产成本。
本研究从菌种选育入手，对产酶特性进行了研究，并采用响应面策略对发酵培养基进行了优化。
介绍了SL发酵罐分批发酵生产高活力纤维素酶的工艺。分离和纯化纤维素酶。培养一代人
双糖酿酒酵母工程菌；对酿酒酵母工程菌细胞的固定化发酵进行了研究，采用两段发酵法
生物反应器灾害系统协同酶解稻草生产燃料乙醇。主要结果如下
1.筛选出一株高产纤维素酶的菌株(青霉YT01)。原生质体经紫外线诱导后。
突变株YT02和YT02以稻草为碳源，豆饼粉和硫酸钱为氮源，在29 ℃,初始P
发酵12Oh，纤维素酶活达到最高，滤纸酶活(FPA)和CMC酶活(CMcas)在摇瓶发酵。
葡萄糖氧化酶活性(CB)分别达到3.86IU/mL、207.41IU/mL和1.4 iu/mL。
2.响应面法优化的发酵培养基组成为:稻草41.95 L，
是24.83g/L，皮数是22.16ba，是H4)2504，KHZpO4是4g/L，MgSO因为0.sg/L;.起源于
在优化培养基中发酵120h后，滤纸酶活、cMc酶活和β-葡萄糖酶活分别达到最高。
国际单位/毫升、357.41IU/毫升和3.704 IU/毫升.远高于优化前的纤维素酶活性水平。
3.在SL发酵罐中研究了温度、pH值和溶解氧对细胞生长和产酶的影响。
发酵的工艺条件为:发酵温度为℃, 0-32h，溶解氧为70%;将H加到1会导致发酵。
29oc，溶解氧50%，发酵液初始pH值6.0，发酵% h的滤纸酶活、CMC酶活和P-葡萄糖。
酶活分别达到11.13IU/mL、465.24 iu/mL和4.08IU/mL，均高于摇瓶发酵。
发酵动力学过程表明，突变株YT02的生长与纤维素酶组分有部分联系。
4.用去头酶A-25和sephadexG-75分离和纯化了两种核酸内切酶。
(CMCase)和一种p-葡萄糖酶，CMCase的纯化倍数为13.48，回收率为10.54%。
糖苷酶纯化倍数为18.62，回收率为8.62%。SDS-PAGE获得单一蛋白分子带。
我
、上海' _心夹3卜''门尸，..
含量分别为73kDa、43kDa和57.8kDa，经N端测序和质谱分析。
5.该工程菌株的受体菌株为酿酒酵母NAN-27，具有优良的乙醇生产性能。使用
PYMIKP是一种很好的多拷贝整合载体，可以将纤维二糖代谢基因BGLI整合到酿酒酵母中。
身体上。因此，在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径，从而扩大了酒精产量。
纤维素的利用范围降低了纤维二糖对纤维素酶水解的抑制作用。采用海藻酸钙凝胶包埋固定。
与游离细胞相比，纤维二糖酿酒酵母工程菌的固定化细胞具有更短的发酵时间和更高的乙醇产量。
能有效利用稻草水解液进行酒精发酵。
6.研究了稻草酶解过程中底物、酶解温度、酶解pH、底物浓度和纤维素酶的性质。
并对其他关键因素进行了研究。由于YT02纤维素酶系中纤维素二纤维素的活性低(CB/F团队是
经过稀酸和碱预处理的稻草纤维素的乙醇转化率仅为65438±08%。使用代谢纤维二糖
纤维二糖对酶解的抑制作用可通过母工程菌的游离细胞发酵部分解除，稻草纤维素对b。
费率可以提高到20%。此外，将固定化的纤维二糖代谢酿酒酵母工人包埋在海藻酸钙凝胶中。
发酵乙醇和稻草纤维素的转化率可达26%。这方面的研究成果有助于深入了解纤维。
共降解机制。
7.纤维原料的酶解和固定化代谢纤维与酿酒酵母工程菌的作用有机联系在一起。
新型两级串联生物反应器在反应器系统的协同作用下能有效去除纤维2。
葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制促进了稻草的酶解，发酵持续40h，b。
直到25.5 L，纤维素到乙醇的转化率达到43.0%(纤维素到乙醇的理论转化率为56.438+0
是SSF的1.65倍，生产效率为0.64 Lh。分批投料
酶促发酵技术可以将纤维底物的最终浓度提高到250陈年，乙醇产物的最终浓度提高到66.51，剩下L，
提高了纤维素酶的利用率和乙醇的生产效率，降低了乙醇的生产成本。该反应器性能稳定。
效率高，固定化细胞可重复使用，便于自动控制。
关键词:纤维素酶，稻草，酿酒酵母，燃料乙醇，系列生物反应器
目录
摘要.................................................................
摘要..........................................................……IH
第一章是文献综述。
稻草资源及其降解方式...............................................
1.1稻草的组成和结构...,...................................,...l
1.2稻草预处理.....................................................3
1.2.1物理方法预处理稻草.............................................3
1.2.2稻草的化学预处理.............................................3
1.2.3稻草的生物预处理.............................................四
1.3稻草纤维素降解模式.............................................四
1.3 1酸水解稻草...................................................5
1.3.2酶水解................................................从稻草中...5
2纤维素酶的性质和用途................................................6
2.1多酶系................................................纤维素酶...6
2.2纤维素酶的分子结构................................................七
2.3纤维素酶的作用机制...................................................9
2.4纤维素酶的分子量................................................10
2.5纤维素酶的最适反应条件和稳定性......................................11
2.6纤维素酶的应用......................................................h
3纤维素酶的生产........................................................12
3.1纤维素酶产生菌的选育..............................................12
3.2纤维素酶的生产......................................................14
4稻草生物转化为燃料乙醇..........................................15
4.1燃料乙醇的优势及使用现状..........................................15
4.2从稻草纤维素生物转化燃料乙醇的方法.............................16
4.2.1分步水解和发酵生产燃料乙醇........................................16
4.2.2燃料乙醇生产.....................................通过同步糖化和发酵...16
我
4.2.3燃料乙醇生产.....................................通过固定化细胞发酵...17
4.3优粮白酒酵母途径项目应用于燃料乙醇的生产................................17.
5 .本研究的目的、意义和主要内容..........................................19
5.1本研究的目的和意义..................................................19
5.2本研究的思路和技术路线..............................................20
5.3本研究的主要内容是....................................................21
第二章纤维素酶产生菌的选育及产酶条件的研究............................23
1材料和方法.............................................................23
1.1材料................................................................23
1.1.1试剂和溶液准备....................................................
1.1.2菌株和菌株分离源..................................................24
1.1.3中号............................................................24
1.1.4主要仪器设备....................................................25
1.2方法................................................................25
稻草的预处理..............................,...,..............25
1.2.2纤维素酶产生菌的分离和纯化.....................................25
1.2.3纤维素酶产生菌的初步鉴定..........................................25
1.2.4突变...............................利用紫外诱变纤维素酶产生菌原生质体...25
一种生产纤维素酶的1.2.5YTOZ液体发酵培养方法...............................26
1.2.6酶水解.....................................从不同预处理的稻草中...27
1.2.7分析方法..........................................................27
2结果和分析............................................................29
2.1不同预处理稻草中各组分的含量...................................29
2.2纤维素酶产生菌的分离和筛选.......................................29
2.3纤维素生产菌株YT01的鉴定.........................................31
2.4 ............................对纤维素酶产生菌YT01的原生质体进行紫外线诱变...31
2.5液体发酵培养基组成和发酵条件对YT02产纤维素酶的影响.................32
2.5.1不同碳源对YT02产酶的影响.........................................32
2.5.2稻草不同预处理对YT02产酶的影响...............................33
2.5.3不同氮源对YT02产纤维素酶的影响...................................34
二
2.5.4添加微晶纤维素对YT02产纤维素酶的影响...........................35
2.5.5不同无机盐对YT01产纤维素酶的影响.................................35
2.5.6初始pH对YT01产纤维素酶的影响....................................36
2.5.7液体负荷对YT02产纤维素酶的影响.....................................37
2.5.8转速对YT02产纤维素酶的影响.......................................37
2.5.9培养温度对YT02产纤维素酶的影响...................................38
2.5.10接种量对YT02产纤维素酶的影响....................................39
2.5.n培养时间对YT02产酶的影响........................................40
2.6纤维素酶酶学性质的研究..............................................41
2.6.1温度对纤维素酶组分活性的影响................................………………………………………………………………………….
2.6.ZPH对纤维素酶组分活性的影响.....................................41
2.7纤维素酶对不同预处理稻草的酶解..............................42
3结论和讨论...............................................4: L。
3.1关于筛选出的高产纤维素酶菌株.......................................4: 3
3.2纤维素酶产生菌的转化...............................................
3.3青霉YT02产酶条件及酶学特性........................................44
第三章YT02产纤维素酶发酵培养基的优化.............................45
1材料和方法....................................45
1.1材料................................................................45
1.1.1试剂................................................45
1.1.2试验菌株.......................................45
1.1.3中号................................................45
1.1.4主要仪器设备....................................................46
1.2方法................................................................4.
1.2.1实验设计.............................................46
1.2.2栽培方法.............................................46
1.2.3分析方法..........................................................46
2结果和分析..............................................47
2.1偏因子实验筛选发酵培养基的主要影响因素............................47
2.2最陡爬坡实验接近发酵培养基的最佳点....................................50
111
2.3中心组合设计优化YT02发酵培养基成分.................................51
2.4发酵过程中PH、残余还原糖和纤维素酶变化的测定结果....................59
3结论和讨论...................................,..............., 61
第四章YT02分批发酵生产纤维素酶的研究...................................63
材料和方法............................................................63
. 1材料................................................................63
. 1.1试剂..............................................................63
. 1.2应变..............................................................63
. 1.3中等............................................................
. 1.4主仪表..........................................................64
方法........................
. 1用于分批发酵的种子培养...........
。…64
。…64
1.2.2恒温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响................................64
1.2.3变温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响................................64
1.2.4溶解氧对YT02分批发酵生产纤维素酶的影响..............................64
1.2.5分溶氧对YT02分批发酵产纤维素酶的影响............................65
1.2.6分析方法..........................................................65
2结果和分析............................................................65
2.1发酵温度对YT02结果纤维素酶产量的影响.................................65
2.2变温发酵对YT02产纤维素酶结果的影响.................................68
2.3溶解氧对YT02产生纤维素酶结果的影响.....................................69
2.4分段溶氧分批发酵对YT02产纤维素酶结果的影响.........................72
3结论和讨论............................................................73
第五章YT02产纤维素酶的分离纯化及酶学性质..............
丁'丁'与U(b
(bt叮‘叮’
材料和方法…
. 1材料...
. 1.1测试材料。
. 1.2主试剂。
....……76
.....……76
. 3普通储备溶液和缓冲液.......................................
1.1.4主仪器...........................................................78
1.2方法.................................................................78
1.2.1蛋白质浓度测定方法..............................................78
1.2.2纤维素酶的分离和纯化.............................................79
1.2.3通过SDS-PAGE凝胶电泳纯化纤维素酶并测定纤维素酶的相对分子量..............83
1.2.4酶蛋白的N端测序..................................................85
1.2.5酶蛋白的质谱分析..................................................86
2结果和分析............................................................87
2.1DEAE-SephadexA-25阴离子交换色谱结果................................
2.1.1微管蛋白与洗脱缓冲液中NaCI浓度的关系为........................87
2.1.2色谱收集的管状酶蛋白活性检测..........................................
2.25即hadexG-75分子筛凝胶过滤色谱的结果.................................88.
2.2.1SephadexG-75分子筛凝胶过滤层析分离酶蛋白.........................
2.2.2通过分子筛凝胶过滤色谱法测定纤维素酶活性...........................88
2.3纤维素酶的纯化在不同的纯化步骤中..........................................89
2.4SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳..........................................90
2.4.1SDS-PAGE银染结果................................
2 . 4 . 2 SDS-PAGE凝胶电泳测定纤维素酶分子量的结果...........................91
2.5酶蛋白的N端测序结果................................................91
2.6酶蛋白的质谱分析结果................................................93
3结论和讨论............................................................94
第六章酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建及细胞固定化研究................96
材料和方法........................................................................................
1材料................................................................96
1.1菌株和质粒........................................................96
1.2 .............................................一种用于分子克隆的酶和试剂...96
1.3稻草水解物的制备..............................................97
2种方法................................................................98
2.1含纤维二糖酶基因的重组质粒pYMIKP的构建方法(及curse 1)。
2.2酿酒酵母中纤维二糖代谢途径的构建方法................................99
1.2.3酿酒酵母工程菌细胞的固定化方法...................................101
1.2.4固定化酵母细胞的发酵方法...........................................102
1.2.5分析方法.........................................................102
2结果和分析...........................................................103
2.1表达和构建具有受调控基因的重组菌株的结果..................................103.
2.1.1目标基因和获得的..............................................103.
2.1.2含目的基因重组质粒的构建....................................103
2.1.3获得酿酒酵母NAN-27的转化体，...........................104.
2.1.4 ..........................1 () 4.
2.2不同固定化条件对NAN-28细胞固定化的影响结果........................105.
2.2.1不同溶剂对固定化细胞转化纤维去润滑的测定结果..................................................................................................................................65438+15
2.2.2不同浓度海藻酸钠对固定化细胞凝胶特性的影响....................L () 5
2.2.3酵母包埋量对固定化细胞转化纤维二糖结果的影响.....................！06
2.3固定化细胞和游离细胞分批发酵的实验结果...............................l () 6
2.4固定化细胞重复分批发酵的结果.....................................107
3结论和讨论...........................................................108
3.1优粮酒酵母纤维二糖代谢途径的构建.......................................108
3.2工程酿酒酵母细胞的固定..........................................110
第七章串联生物反应器生产燃料乙醇的研究.................112
材料和方法...........................................................112
l材料..........................................................112.
1.1试剂............................................................112.
1.2菌株............................................................112
1.3主要仪器设备..................................................112
方法..............................................................112.
2.1稻草粉的预处理...................................................112
2.2纤维素酶的制备................................................113
2.3稻草粉的酶解糖化.................................................113
2.4稻草生物转化为燃料乙醇.........................................114
2.5测定方法.........................................................115
视觉识别系统
2结果和分析...........................................................116
2.1不同预处理方法对稻草糖化效果的影响结果............................116
2.2不同温度对稻草糖化效果的影响结果...............................116
2.3不同pH值对稻草粉糖化效果的影响结果..................................117.
2.4不同酶用量对稻草粉糖化效果的影响结果...............................118.
2.5不同底物浓度对稻草粉糖化效果的影响结果.............................118
2.6稻草SSF的结果....................................119.
2.7串联反应器转化稻草生产乙醇...................................120
2.7.1固定化NAN-28细胞发酵生产燃料乙醇结果.........................120.
2.7.2串联生物反应器的稳定性结果.....................................121.
2.7.3 ...........................122，分批补料协同酶发酵生产燃料乙醇的结果。
3结论和讨论......................................................122
3.1两级串联生物反应器生产乙醇.......................................122
3.2分批补料协同酶解发酵工艺.........................................123
3.3稻草资源的充分利用...............................................123
第八章结论........................................................124
主要参考.........................................................126.
英文缩写和主要符号列表..................................................146
本研究的特点和创新点....................................................147
已发表和拟发表的学术论文和成果..........................................148
由于...............................................................149
作者简介.............................................................150
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