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特异性移植耐受是指受者的免疫系统对同种异体或异种供体抗原长期不产生免疫应答，而对其他抗原能产生正常免疫应答，不使用免疫抑制药物的状态。目前认为诱导免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽视四种机制。自从Petersen等人在1999发现肝卵圆细胞可以来源于骨髓后，从骨髓细胞中鉴别肝干细胞成为近年来的热点。目前已有研究证实，从骨髓中分离纯化的造血干细胞的多个亚群在一定的微环境或细胞因子诱导下可分化为肝干细胞[B]。目前已发现骨髓中许多细胞亚群具有分化为肝细胞的潜能。如KTLS细胞(c-kithighylowlin-SCA-1+)[h]、β2-m-Thy-1+细胞[12]、CD44-CD45-HLA-c-kit-多能成体前体细胞(multipotable)。这些细胞都涉及许多不同的表面标记，它们可能代表骨髓干细胞的不同发育阶段或不同分支。这些细胞因子必须存在于细胞的微环境中，包括细胞外基质中参与黏附过程的信号分子和参与正常细胞发育、分化、成熟的细胞因子[B] [E]。Petersen等[L]、Theise等[M，N]和Alison等[O]的研究先后指出，骨髓干细胞或造血干细胞在小鼠肝脏中可以转化为肝卵圆细胞甚至成熟肝细胞和胆管细胞，同时证明了这种现象在人体中也存在。高浓度肝细胞生长因子(HGF)诱导体外培养的大鼠骨髓细胞，RT-PCR检测白蛋白和甲胎蛋白的表达。免疫细胞化学也证实诱导后的细胞具有AFP、白蛋白、CK8/18等肝前体细胞的特征性表达。用磁应变细胞筛选法从人或大鼠骨髓细胞中分离出β2m-Thy-1+细胞，可以表达肝细胞的特征[P]。这些骨髓来源的肝干细胞(BDHSC)在肝内移植后很快整合到肝板上，并分化为成熟的肝细胞。在体外培养过程中加入胆汁血清可以促进其分化为肝细胞。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分离出骨髓干细胞的多个亚群，并证明大鼠骨髓中β2微球蛋白阴性(β2 m-)细胞经体外培养诱导后呈多角形细胞，白蛋白、AFP、CK8/1 8呈阳性，而其他干细胞类型未出现类似变化。提示骨髓干细胞的这一亚群具有分化为肝干细胞的能力。根据他们介绍的方法，我们成功地分离出数量级为1.5×105的肝干细胞。纯度为95%，培养7天可达2×106量级。免疫组织化学染色显示其具有肝细胞、胆管上皮细胞和血管内皮细胞的特异性标记，因此推测其可能分化为上述三种细胞(见研究工作基础)。这些结果都表明，骨髓细胞中存在可以分化为肝细胞的干细胞。
肝脏基因治疗的一个大问题是作为基因修饰的成熟肝细胞不容易在体外扩增和传代。肝干细胞具有很强的增殖能力，即使经过基因修饰，仍有可能传代，这为克服目前基因治疗中的主要问题开辟了新的途径。肝干细胞作为载体具有一次性干预和永久治疗的特点，永生化肝干细胞不致癌[F]。
基于上述研究结果，我们假设肝脏干细胞可以靶向并定植于肝脏汇管区中央静脉周围，必要时可以分化和补充受损或老化的血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肝细胞的生物学特性。以腺相关病毒为载体，将DcR3基因转入从雄性近交系Wistar大鼠骨髓中分离纯化的肝干细胞中，将雌性近交系Wistar大鼠的肝脏移植到雌性近交系Lewis大鼠中，将转染了DcR3基因的肝干细胞通过门静脉注射到移植肝脏中。随着肝干细胞的定植，DcR3基因主要在汇管区持续表达，必要时随着肝干细胞的进一步分化，在血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肝细胞中部分表达，从而在起始(原发)和攻击(继发)两个环节抑制排斥反应的发生。DcR3基因的强免疫抑制作用局限于肝脏，从而诱导肝脏特异性的移植耐受状态。
参考
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2.研究内容、研究目标和需要解决的关键问题。(这部分重点是内容)
2.1研究内容
2.1.1构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，转染入AAV293细胞，收集AAV病毒颗粒备用。
2.1.2从雄性近交系Wistar大鼠股骨和胫骨提取骨髓，分离肝干细胞，转染上述腺相关病毒颗粒，鉴定其表达。
2.1.3将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠体内，将转染的雄性近交系Wistar大鼠肝干细胞经门静脉注入肝脏。
2.1.4根据Y染色体和AAV病毒载体的绿色荧光蛋白(GFP)标记，确定转基因肝干细胞在供体肝脏中的定植和分布。
2.1.5检测转入肝干细胞的DcR3基因在供体肝脏中的表达。
2.1.6观察肝移植术后移植排斥反应的发生情况。
2.2研究目标:本项目拟构建携带DcR3基因的腺相关病毒，并转染至雄性近交系Wistar大鼠骨髓来源的肝干细胞；将雌性近交系Wistar大鼠的肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠体内，将转染DcR3基因的肝干细胞通过门静脉注入移植肝脏。DcR3基因在供体肝脏中长时间表达，从而诱导肝脏特异性的移植耐受状态。探讨(1)转基因肝干细胞在供肝中的定植和分布。(DcR3基因转入肝干细胞后在供肝中的表达。(3)转基因肝干细胞在供肝中的分布及其基因表达与移植耐受的关系。
2.3需要解决的关键问题
2.3.1腺相关病毒转染肝干细胞的效率:干细胞的基因转染难度较大，是本项目的关键环节之一。本项目成员(已删除)在2001成功用腺病毒感染神经干细胞，成功率约为80% ~ 90%，经12代传代培养后仍具有干细胞特征。腺相关病毒的转染效率比腺病毒高，转染的细胞类型比腺病毒更广泛。因此，我们的研究组有能力完成腺相关病毒对肝干细胞的转染。
2.3.2转基因肝干细胞在供肝汇管区的定植数量:肝干细胞在汇管区的定植数量与肝脏损伤程度有关。损伤越严重，在汇管区定居的肝干细胞数量越多，反之亦然。肝脏缺血再灌注是肝移植过程中对肝脏的一种损伤。为了进一步提高汇管区肝干细胞的数量，可以在冷保存时切除一片大鼠肝脏的叶子，然后完成肝移植。
3.提出研究方案及可行性分析。(包括相关方法、技术路线、实验手段和关键技术的描述)
3.1研究方案
3.1.1根据Pitti RM等介绍的方法克隆了DcR3基因。
3.1.2构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，用其感染AAV-293细胞进行体外表达鉴定，收集AAV病毒颗粒备用。
3.1.3取雄性近交系Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓，按Itzhak Avital介绍的方法分离、纯化和鉴定肝干细胞。
肝干细胞转染3.1.4腺相关病毒载体，采用直接感染。
3.1.5体外试验:表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导的淋巴细胞凋亡；表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导的淋巴细胞趋化
3.1.6动物实验:采用袖套法进行大鼠肝移植，移植后将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入肝脏；分别于术后第3、7、65、438+04、26、438+0和28天取血和肝标本，常规生化方法检测肝功能，Northern blot和Western blot检测肝脏中DcR3基因的表达，免疫组化法检测供肝中CD4+和CD8+淋巴细胞的浸润，TUNEL法检测供肝中细胞凋亡。
3.2技术路线
3.3可行性分析
3.3.1理论上，来源于骨髓的肝干细胞是肝脏汇管区卵圆细胞和嗜碱性小肝细胞的前体细胞。已有研究证明，经门静脉注射的肝干细胞移植的肝脏，其汇管区的赫林小管可分化为血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肝细胞。肝门区是肝移植排斥反应中CTL细胞的第一浸润区，血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肝细胞是CTL细胞攻击的靶细胞。因此，肝干细胞将转染的免疫抑制基因带入肝脏，并在血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肝细胞中持续表达，从而诱导特异性针对肝脏的移植耐受，在理论上是可行的。
3.3.2本研究涉及的技术均为成熟的免疫学技术；我们研究所拥有进行这项研究的必要设备和条件。
4.本项目的特点和创新点。
本研究利用肝干细胞在肝脏定植和分化的靶向性作为免疫抑制分子的载体，使非特异性免疫抑制分子的作用仅限于肝脏，克服了免疫抑制分子作用范围过大的缺点，从而诱导出肝脏特异性的移植耐受状态。
5 .年度研究计划和预期研究成果。(包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等。)
年度研究计划
从2005.01到2005.09克隆DcR3基因，构建携带DCR3基因的腺相关病毒载体备用。
从2005.10至2006年6月，分离、纯化和鉴定来自雄性近交系大鼠骨髓的肝干细胞，并用腺相关病毒转染。DcR3基因的体外表达及鉴定:转染DcR3基因的体外功能实验。
2006年7月至2007年6月完成肝移植动物模型，将转染的肝干细胞经门静脉注入肝脏。定期取肝标本，根据Y染色体标记染色和GFP确定转基因肝干细胞在供肝中的定植和分布。检测转入肝干细胞的基因在肝脏中的表达；移植排斥的发生。
2007年7月-2007年6月，2007年438+2月，补充实验遗漏，整理实验数据，统计处理实验数据，写论文。
预期研究结果
1.证明转染DcR3基因的肝干细胞可在供体汇管区和部分血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肝细胞中持续表达，并诱导肝移植的长期免疫耐受。
2.在国外学术期刊发表论文2-3篇，在国内核心期刊发表论文6-8篇，在国内学术会议上交流。
(2)研究基础和工作条件
1.工作基础(与本项目相关的研究工作积累和研究工作成果)
成绩是2月底到3月初出来的。
2 .工作条件(包括现有的实验条件、实验条件的不足及解决途径，包括国家重点实验室和部门开放实验室的计划和实施情况。)
删除
3.申请人简历(包括申请人及项目组主要成员的学历及研究工作简历、近期发表的与本项目相关的主要著作目录、获得的学术奖项及在本项目中承担的任务。)
删除
(三)资金申请情况说明(要求按照《国家自然科学基金委资金管理办法》认真填写，资金在5万元以上的固定资产和设备采购，应逐项说明项目研究的直接相关性和必要性。)
(4)其他附件清单(附件材料复印后随纸质申请表一并提交)(随纸质申请表一并提交的附件清单，如中级技术职称申请人的推荐信或在职研究生申请项目导师的推荐信等。).)