无盐染色纸
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一般方法:
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
[原则]
SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量是20世纪60年代末由Weber和Osborn在Shapiro等人发展起来的一项新技术。这种测定蛋白质分子量的方法具有快速、方便、设备简单的优点。
在一般的电泳方法中，蛋白质的电泳迁移率主要取决于其在一定PH下的净电荷、分子大小(即分子量)和形状的差异，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要取决于大部分蛋白质的分子量，而与原始电荷和形状无关。
SDS是一种阴离子表面活性剂。在一定条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，按比例与这些蛋白质分子结合，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。一般每克蛋白质结合1.4g SDS。SDS与蛋白质的结合，使得蛋白质-SDS复合物都带相同的负电荷，远远超过蛋白质原有的电荷，从而掩盖了蛋白质之间原有的电荷差异。在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，类似于雪茄形的长椭圆棒(短轴为1.8nm，长轴与蛋白质的分子量成正比)，从而克服了蛋白质之间原有的形状差异。这样，蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原始电荷和形状的影响，而仅仅是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子量和电泳迁移率之间的关系可以用下面的公式表示:
lgMr = K–BM
其中Mr是分子量；k是常数；b是斜率；m是流动性。
所以用这种方法测定蛋白质的分子量，只需要根据已知分子量的标准蛋白质的lgMr~ ~淌度图中待测蛋白质的位置就可以知道分子量。
用这种方法测得的分子量，除了单链蛋白质，并不是天然蛋白质的完整分子量，而是组成这些蛋白质的亚基或肽链的分子量。这种方法不适用于一些电荷或构象异常的蛋白质，或带有较大辅助基团的蛋白质，如组蛋白F1和一些糖蛋白。它也不适合一些结构蛋白，如胶原蛋白。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳根据凝胶电泳体系中缓冲液、pH值、凝胶孔径的不同，可分为SDS-连续体系电泳和SDS-不连续体系电泳。根据凝胶形状和电泳方式可分为SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直管电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳两种。
本实验采用SDS-不连续垂直平板操作法。通过实验，使学生掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的原理和技术，包括凝胶制备、凝胶填充、加样、凝胶剥离和固定染色，学会用这些方法测定蛋白质的分子量。
[方法和步骤]
1.加样溶液的制备
1、标准蛋白样品溶液的制备称取细胞色素、胰凝乳蛋白酶原、胃蛋白酶、卵清蛋白和牛血清白蛋白各0.5 ~ 1 mg，置于小型离心管(Eppendorf管)中，加入样品溶液1mL，充分溶解，离心除去任何不溶物。在沸水浴中热处理3min，冷却备用。
2.待测蛋白质样品溶液的制备。
根据待测蛋白质样品的存在情况，对蛋白质样品进行定量分析。
(1)固体
对于待测蛋白样品，如果是无盐纯蛋白固体制剂，加样溶液的制备方法与标准蛋白加样溶液相同；如果是含盐的纯蛋白固体制剂，应加水充分溶解，对着透析缓冲液透析12 ~ 16h，然后吸取0.5mL(蛋白浓度应为0.5 ~ 1 mg/ml)，置于Eppendorf管中，加入等体积的浓缩样液，沸水浴热处理3min，冷却备用。
(2)液体
如果待测蛋白样品为无盐纯蛋白液体制剂，加入相同体积的浓缩样品溶液，然后进行热处理；如果是含盐的液体制剂，首先需要透析。
二、凝胶的制备
1，凝胶板的制备
(1)洗涤板
将洗洁精用温水稀释后，用它浸泡海绵擦洗玻璃板，然后用自来水冲洗，用酒精擦干。
(2)安装橡胶板
打胶前，将玻璃板与塑料嵌条、凹面陶瓷板边缘对齐，用密封胶带密封，两端用塑料夹或铁夹夹住，注意保证密封，放在固定架上。
2.分离胶和浓缩胶液的制备
成分
分离胶/毫升
浓缩胶/毫升
凝胶原液
2.5
0.26
分离凝胶缓冲液(pH8.8)
1.9
—
浓缩凝胶缓冲液(pH6.8)
—
0.5
10%十二烷基硫酸钠
0.075
0.02
特梅德
0.026
0.02
双蒸水
3.05
1.22
10%过硫酸铵
0.013
0.02
总体积
7.6
2
注:①最后加入10%过硫酸铵溶液，混合制成凝胶溶液，快速倒凝胶。
(2)丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激性。所以一定要注意不要吸入和接触皮肤，全聚合聚丙烯酰胺凝胶是无毒的。
3、制备隔离胶
将制胶板垂直放置，插入相应厚度的样品梳，在1cm处标出梳子下边缘线，取下样品梳。将配制好的隔离胶液缓慢加入制胶板之间，直至液面达到标记。用滴管紧贴胶界面，小心缓慢地覆盖约0.5cm厚的正丁醇层，防止溶液蒸发，保证胶面平整。
4、制作浓缩胶
聚合后，倒掉正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面两次，用滤纸吸去残液。用滴管将浓胶液加入分离胶面，填满制胶板，插入样梳。
(3)电泳
1.安装电泳槽
浓缩粘合剂聚合后，拆下梳子、密封带和六个铁夹。将橡胶板、电泳槽内芯和另一对橡胶板依次放入槽中。双系统胶板的凹面陶瓷板应与电泳槽内芯接触。然后插入楔形板固定两套制胶板。如果每次电泳只使用一块橡胶板，则必须用提供的有机玻璃板替换另一组橡胶板。
2.添加样本
用缓冲溶液填充内外槽，使内外槽的水位超过凹板的间隙但低于塑料板的上边缘。用微量取样器将样品加入梳状孔中。
3.电泳
盖上上盖，在80 V ~ 100 V电压下电泳约3小时，直到溴酚蓝指示的电泳前沿到达胶板下沿，关闭电源。然后拉出楔形板，取下橡胶扳手。
(4)染色和脱色
用刀片或薄板将白色塑料板从陶瓷板上轻轻撬开，用刀片沿着分离胶和浓缩胶的交界处将分离胶切断，在分离胶的左上角切下一个小角，以标记样品顺序。然后戴上橡胶手套，小心地将分离胶移入染色容器。将100mL考马斯亮蓝染色液(含0.25%考马斯亮蓝R-250，30%乙醇，10%醋酸水溶液)加入染色容器中，盖上盖子，在摇床上染色2小时。
将染料溶液倒回储存瓶中(可重复使用)。向染色皿中加入100mL脱色液(10%乙酸，30%乙醇)，摇匀脱色至蛋白带清晰。
[结果和计算]
1.凝胶剥去背景色后，色带清晰可见。根据真实样品描摹或拍摄电泳图谱。
2.根据每种蛋白质的迁移距离与染料迁移距离的比值，计算出每种蛋白质的相对迁移率mr，然后画出LGmr ~ mr图，从中求出未知蛋白质MR对应的分子量。