什么是聚合酶链式反应？

聚合酶链式反应(简称PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。它可以被视为一种特殊的体外DNA复制。

DNA聚合酶I最早发现于1955，而更有实验价值和实用性的大肠杆菌Klenow片段是H. Klenow博士在70年代初发现的。但由于这种酶不耐高温，在高温下可以变性，所以不适合使用高温变性的聚合酶链式反应。今天使用的酶(简称Taq聚合酶)是1976年从温泉的细菌中分离出来的。由于耐高温，是一种理想的酶，但在20世纪80年代后被广泛应用，PCR最初的原型概念是相似基因修复复制，由Kjell Kleppe博士在1971中提出。他发表了第一个简单而短暂的基因复制实验(类似于PCR的前两个循环)。今天开发的PCR是由卡里·B·穆利斯博士在1983中开发的。Mullis博士当年就职于PE公司，所以PE公司在PCR领域有着特殊的地位。穆利斯博士在1985与斋祀等人发表了第一篇相关论文。此后，PCR的应用突飞猛进，相关论文的质量可以说是其他许多研究方法无法比拟的。随后，PCR技术被广泛应用于生物学研究和临床应用，成为分子生物学研究中最重要的技术。穆利斯还获得了1993诺贝尔化学奖。

[编辑本段] [PCR原理]

DNA的半保守复制是生物进化和传代的重要方式。双链DNA可以在多种酶的作用下变性熔化成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对的原理复制到同一个两分子贻贝中。实验中发现，DNA在高温下可以变性熔化，降温时可以重折叠成双链。因此，DNA的变性和复性可以通过温度变化来控制，DNA聚合酶和dNTP可以通过添加设计好的引物来完成特定基因的体外复制。

但DNA聚合酶在高温下会失活，因此每循环都需要添加新的DNA聚合酶，不仅操作繁琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热的DNA聚合酶- Taq酶是PCR应用中的一个里程碑。该酶可以耐受90℃以上的高温而不丧失活性，这使得PCR技术非常简单，大大降低了成本。PCR技术已经得到广泛应用，并逐渐应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的自然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由三个基本反应步骤组成:变性-退火-延伸:①模板DNA的变性:模板DNA加热到93℃左右一定时间后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增的双链DNA解离成单链，从而可以与引物结合，为下一轮反应做准备；(2)模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA加热变性为单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物延伸:DNA模板-引物偶联物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基互补配对和半保守复制的原理，可以合成与模板DNA链互补的新的半保守复制链，重复循环变性-退火-延伸三个过程，可以得到更多的“半保守复制链”，这个新链可以作为下一个循环的模板。完成一个循环需要2 ~ 4分钟，待扩增的目的基因在2 ~ 3小时内可扩增百万倍。

[编辑本段][PCR反应系统和反应条件]

1.标准PCR反应系统

10×扩增缓冲液10μl

200μl四种dNTP的混合物。

引物10～100μl

模板DNA 0.1 ~ 2 μ g

Taq DNA聚合酶2.5微升

Mg2+1.5毫摩尔/升

添加双份或三份蒸馏水100μ l

PCR反应五要素:参与PCR反应的主要物质有五种，分别是:

引物(PCR引物是DNA片段，细胞内DNA复制的引物是RNA链)、酶、dNTP、模板、缓冲液(需要Mg2+)。

引物的设计方法有很多种，由实验中PCR的目的决定。但是基本原理是一样的。

PCR中使用的酶有两个主要来源:Taq和Pfu。来自两种不同的嗜热细菌。其中，Taq扩增效率高，但出现了错配。Pfu放大效率较弱，但具有纠错功能。所以在实际使用中一定要根据需要做出不同的选择。

用于扩增的模板DNA可以来自任何来源，但有两个原则。一是纯度一定要高，二是浓度不能太高，以免抑制。

缓冲液的成分最为复杂，一般包括除水以外的四种有效成分:缓冲系统，一般采用HEPES或MOPS缓冲系统；单价阳离子一般使用钾离子，但特殊情况下也可使用铵离子；二价阳离子即镁离子根据反应体系确定，除特殊情况外无需调整；辅助成分，如DMSO和甘油，主要用于维持酶的活性，帮助DNA接触缠绕结构。

2.PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5’引物和3’引物。基于单个DNA链(通常基于信息链)设计引物，5’-末端引物与位于待扩增片段5’-末端上游的短DNA序列相同；3’端的引物与待扩增片段3’端的短DNA序列互补。

引物设计的基本原则

①引物长度:15-30bp，一般在20bp左右。

②引物碱基:G+C的含量应在40-60%，G+C过少不利于扩增，G+C过多易产生非特异性条带。ATGC最好随机分布，以避免超过5个嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

③引物中不应有互补序列。

④两条引物之间不能有互补序列，特别是要避免3’端的互补重叠。

⑤引物与非特异性扩增区序列的同源性不能超过70%，引物3’端的8个碱基不能有待扩增区以外的完全互补序列，否则容易导致非特异性扩增。

⑥引物3’端的碱基，尤其是最后一个和倒数第二个碱基要严格匹配，最好选择G和C..

⑦引物的5’端可以被修饰。如添加限制性酶切位点、引入突变位点、用生物素、荧光物质和地高辛标记、添加其他短序列，包括起始密码子和终止密码子。

五.引物设计软件

Primer Premier5.0(自动搜索)*

VOligo6(引物评价)

向量NTI西装

vDNAsis

沃米加

vDNAstar

VPrimer3(在线服务)

3.模板的准备

PCR的模板可以是DNA或RNA。

模板主要基于PCR的扩增对象，可以是病毒、细菌、真菌等病原体样本。也可以是细胞、血液、羊水细胞等病理生理标本。法医标本有血斑、精斑、毛发等。

样品处理的基本要求是去除杂质和部分纯化样品中的核酸。大多数样品需要用SDS和蛋白酶k处理，难以破碎的细菌可以用溶菌酶和EDTA处理。得到的粗DNA用苯酚和氯仿提取纯化，再用乙醇沉淀，作为PCR反应的模板。

4.PCR反应条件的控制

①①PCR反应的缓冲液提供合适的pH和一些离子。

②镁离子总浓度应高于dNTPs，常用为1.5 mmol/L。

(3)底物浓度dNTP配制成等摩尔浓度，20 ~ 200 μm ol/l

④TaqDNA聚合酶2.5U(100ul)

⑤引物浓度一般为0.1 ~ 0.5 umol/L。

⑥反应温度和循环时间

变性温度和时间95℃，30s。

退火温度和时间比底漆的Tm值低5℃左右，一般在45 ~ 55℃。

延伸温度和时间为72℃，1min/KB(10kB以内)。

Tm值= 4 (g+c)+2 (a+t)

循环次数:一般25 ~ 30次。循环次数决定了PCR扩增的产量。模板初始浓度较低，可以增加循环次数以达到有效扩增。但是循环次数不能无限增加。一般循环次数在30次左右。循环次数超过30次后，DNA聚合酶的活性逐渐达到饱和，产物量不再随循环次数的增加而增加，产生所谓的“平台期”。

[编辑此段落] [PCR步骤]

标准PCR过程分为三个步骤:

1.DNA变性(90℃-96℃):在热的作用下，双链DNA模板的氢键断裂，形成单链DNA。

2.退火(25℃-65℃):系统温度降低，引物与DNA模板结合形成局部双链。

3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下(72℃左右，活性最好)，以dNTP为原料，从引物的5’端延伸到3’端，合成一条与模板互补的DNA链。

在每个循环中的变性、退火和延伸之后，DNA含量加倍。如图所示:

目前有些PCR由于扩增区域很短，即使Taq酶活性不是最适，也能在短时间内复制，因此可以改为两步法，即退火和延伸在60℃-65℃同时进行，以减少一次加热和冷却过程，提高反应速度。

[编辑本段] [PCR检测]

PCR反应扩增出高拷贝数，接下来的检测就成了关键。荧光素(EB)染色凝胶电泳是最常用的检测方法。电泳检测的特异性不是太高，所以引物二聚体等非特异性杂交容易造成误判。但由于其简单性，成为了主流的检测方法。近年来，以荧光探针为代表的检测方法逐渐取代了电泳。

[编辑本段] [PCR反应特征]

强特异性

PCR反应的特定决定因素是:

①引物和模板DNA的特异性正确组合；

②碱基配对原理；

③Taq DNA聚合酶合成反应的真实性；

④目的基因的特异性和保守性。

引物和模板的正确组合是关键。引物与模板的结合和引物链的延伸遵循碱基配对的原理。由于聚合酶合成反应的保真性和TaqDNA聚合酶的耐高温性，反应中模板和引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，扩增的目的基因片段可以保持较高的准确性。通过选择特异性高、保守的靶基因区域，其特异性会更高。

高灵敏度

PCR产物量呈指数级增加，可以将待测初始模板按皮克(pg=10-12)级扩增到μg=-6的水平。可以从654.38+0万个细胞中检测出一个目标细胞；在病毒检测中，PCR的灵敏度可达3 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中，最低检出率为3个细菌。

简单快捷

耐高温Taq DNA聚合酶用于PCR反应。反应液一次性加入后，在DNA扩增液和水浴锅中进行变性-退火-延伸反应，扩增反应一般在2 ~ 4小时内完成。扩增产物一般用电泳分析，不需要同位素，所以没有放射性污染，易于推广。

标本纯度低。

不需要分离病毒或细菌和培养细胞，可以用粗DNA和RNA作为扩增模板。可直接用于血液、体腔液、漱口液、头发、细胞、活组织等临床标本的DNA扩增和检测。

[编辑此段][循环参数的]〔PCR]

1，初始变性。

模板DNA的完全变性和PCR酶的完全激活对PCR的成功非常重要。建议加热时间参考试剂说明，未修饰Taq酶的激活时间一般为两分钟。

2、循环中的变性步骤

一般循环中95℃30秒就足以使各种靶DNA序列完全变性，如果可能的话可以缩短这一步的时间。

变性时间过长损害酶活性，过短目标序列变性不彻底，容易导致扩增失败。

3.引物退火

退火温度需要从多方面来确定。一般根据引物的Tm值，根据扩增长度适当降低退火温度。然后在这个实验的基础上做一个估计。

退火温度对PCR的特异性有很大影响。

4.引物延伸

引物延伸通常在72℃(Taq酶的最适温度)进行。然而，当扩增长度短且退火温度高时，可以省略该步骤。

延伸时间取决于扩增片段的长度，一般建议在1000bp以上，用Pfu及其衍生物衍生设定为1min/kbp。

5、循环次数

大多数PCR包含25-40个循环，容易产生非特异性扩增。

6、最后一次延期

最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟，使引物完全延伸，单链产物退火成双链。

(PCR中的污染和假阳性

PCR中的污染主要来自

1，样本间交叉污染；

2.以前PCR产物的遗留物。