毕业论文扫描
提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面。一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术、用于快速测量的SHG技术和用于活细胞研究的MPM技术。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术(如STED和SSIM技术)相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微技术的支持，人们迫切需要更新显微技术以适应时代发展的要求。近年来的研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破了200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率甚至超高分辨率光学显微镜的发展不仅在于技术本身的进步，还将极大地促进生物样品的研究，为亚细胞和分子水平的研究提供新的手段。
光学显微镜；分辨率高；非线性技术；纳米级
显微技术在生物学的发展中发挥了重要作用，尤其是早期显微技术领域的一些重要发现，直接促成了细胞生物学及相关学科的突破性发展。对固定样品和活样品的生物结构和过程的观察，使光学显微镜成为大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学研究从整体物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及其对细微细节的分辨能力成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在可见光400 ~ 760 nm范围内，显微镜的分辨率极限约为光波波长的一半，约为200nm，而最新研究成果达到的极限值为20 ~ 30 nm。本文从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面综述了高分辨率光学显微镜的技术原理和近年来突破光的衍射极限的研究进展。
1传统光学显微镜的分辨率
光学显微镜图像的大小主要取决于光的波长和显微镜物镜的有限尺寸。像空间中类似于点光源的物体的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(PSF)。由于光学系统的特性和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正的线性平移不变系统，PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿Z光轴方向有明显的膨胀。根据瑞利准则，两点间可分辨的最小距离约等于点扩散函数的宽度。
根据瑞利判据，传统光学显微镜的分辨率极限由下式表示[1]:
横向分辨率(x-y平面):dx，y=■
轴向分辨率(沿Z轴):dz=■
可以看出，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜数值孔径N.A的制约。PSF越窄，光学成像系统的分辨率越高。提高分辨率有两种方法:(1)选择更短的波长；(2)为了提高数值孔径，使用高折射率的材料。
瑞利判据是基于传播波的假设。如果能探测到非辐射场，就有可能突破瑞利判据对衍射屏障的限制。
高分辨率三维显微镜
在提高光学显微镜分辨率的研究中，校正显微镜物镜的像差和色差具有重要意义。光学显微镜的成像质量从一般的透镜组合方式到使用光阑限制非傍轴光，从稳定的消色差到复色差再到超色差都有明显的提高。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，开展了显微镜像差校正的相关研究。自适应光学系统由波前传感器、变形透镜、计算机、控制硬件和专用软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并自动校正。一般来说，现有的高分辨率三维显微术可分为三类:* *聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。
2.1 ***聚焦显微术和去卷积显微术解决厚生物样品显微成像比较成熟的方法是***聚焦显微术[4]和三维去卷积显微术(3-DDM) [5]，这两种方法都是在不制备样品物理切片的情况下才能使用。
* * *聚焦显微镜的主要特点是通过使用检测针孔去除非* *焦平面荧光靶产生的荧光，从而提高图像对比度。* * *聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF成平方，分辨率提高约■倍。为了获得满意的图像，三维聚焦技术往往需要使用高强度的激发光，这就导致了染料漂白和对活体生物样品的光毒性。另外，结构复杂，价格昂贵，在一定程度上限制了应用。
3-DDM使用软件处理整个光学切片序列。与* * *聚焦显微镜相比，该技术使用低强度激发光，降低了光漂白和光毒性，适合长时间研究活体生物样品。利用科学冷却的CCD传感器同时探测焦平面和近离焦平面的光子，动态范围宽，曝光时间长，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽视场荧光显微镜的应用领域，引起了生命科学领域的广泛关注[6]。
2.2选择性平面照明显微术根据大型活体生物样品的光吸收和散射特性，Huisken[7]等人开发了选择性平面照明显微术(SPIM)。与通常在载玻片上切割和固定样品的方式不同，SPIM可以在近似自然状态下观察2 ~ 3毫米的较大活体生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄光学窗口形成超薄层光，在超薄层照明下移动样品获得切片图像，还可以通过可旋转的载物台对样品进行不同观察角度的扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。由于使用了超薄层光，SPIM减少了光对活体生物样本的损伤，使完整的样本能够继续存活和生长，这是目前其他光学显微镜无法做到的。SPIM技术的出现为观察大型活体样本的瞬时生物现象提供了合适的显微工具，对发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特殊意义。
2.3结构照明技术和干涉成像当荧光显微镜用高数值孔径的物镜对厚的生物样品成像时，光学切片是获得高分辨率三维数据的理想方法，包括* * *聚焦显微镜、三维去卷积显微镜和尼普可夫圆盘显微镜。Neil等人在1997中报道的基于结构照明的显微术是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，可以获得与* * *聚焦显微镜相同的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜1993中的应用最早由Lanni等人提出，随着I5M、HELM、4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜观察到的荧光相比，干涉成像技术记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。(1)结构光技术:它结合了专门设计的硬件系统和软件系统。硬件包括网格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为了产生光学切片，用CCD采集对应于网格线不同位置的原始投影图像。通过软件计算，得到了清晰的、无离焦面杂散荧光的图像，图像的对比度和清晰度明显提高。利用结构照明的光学层析技术，解决了2D光学层析和三维荧光成像中离焦面杂散光的干扰、重建耗时和计算时间长的问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率是常规荧光显微镜的2倍，3D成像速度是* * *聚焦显微镜的3倍。(2)4Pi显微镜:基于干涉原理的4Pi显微镜是* * *聚焦/双光子显微镜技术的延伸。4Pi显微镜在标本前后装有1个共焦点物镜，可通过三种方式获得高分辨率成像:①标本被两个波前产生的干涉光照射；(2)探测器探测两个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前都是干涉光。4Pi显微镜在* * *聚焦模式下使用激光作为照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比* * *聚焦荧光显微镜技术高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，可以实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等人[8，9]利用多束平行光束和1双光子装置观察活细胞中线粒体、高尔基体等细胞器的细微细节。Carl[10]首次使用4Pi显微镜测量了哺乳动物HEK293细胞细胞膜上Kir2.1离子通道的类型。结果表明，4Pi显微镜可用于纳米分辨率的细胞膜结构形态研究。(3)图像干涉显微镜(I2M):用两个高数值孔径的物镜和一个分束镜采集同一焦平面上的荧光图像，并使其在CCD平面上干涉。1996年，古斯塔夫森等人利用这种双物镜，用非相干光源(如汞灯)从两面照射样品，发明了I3m显微镜技术(非相干、干涉、照明显微术，I3M)，并与I2M相结合，形成了I5M显微镜技术。在测量过程中，通过对* * *焦平面内的样品进行逐层扫描，得到一系列图像，然后对数据进行适当的去卷积，就可以得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨率范围在100nm以内。
2.4非线性高分辨率显微镜非线性现象可用于检测非常少量的荧光甚至未标记的样品。虽然有些技术还处于物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术相结合，有很大的发展空间。(1)多光子激发显微术:(MPEM)是* * *聚焦显微镜和多光子激发荧光技术相结合的一种显微术，不仅可以产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性的问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光是由同时吸收的两个甚至三个光子产生的，荧光强度与光致发光强度的平方成正比。对于聚焦光束产生的斜锥形激光分布，多光子激发只能在样品中心进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，对周围细胞和组织的损伤明显降低，这使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM的轴向分辨率高于* * *聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。(2)受激发射损失显微术:Westphal[12]最近实现了Hell在1994之前提出的受激发射损失(STED)成像的概念。STED成像利用了荧光饱和度和激发荧光损失之间的非线性关系。STED技术使用两个脉冲激光器来确保样品中发射的荧光量非常小。第1激光作为激发光激发荧光分子；第二束激光照射样品，其波长能使发光物质分子被激发后立即回到基态。焦点上那些遭受STED光损失的荧光分子失去了发射荧光光子的能力，而剩余的发射荧光区域被限制在小于衍射极限的区域，因此获得了小于衍射极限的光斑。Hell等人已经获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12，13]，并且完全分离了距离为62nm的两个同类分子。最近STED和4Pi显微镜的轴向分辨率已经低至28nm，首次证明免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。(3)饱和结构照明显微术:Heintzmann等人[15]提出了饱和结构照明显微术的理论假设，与STED的概念相反，最近被Gustafsson等人[16]验证成功。当光强度增加时，这些体积将变得非常小，小于任何PSF的宽度。利用这种技术，已经实现了小于50纳米的分辨率。(4)二次谐波产生(SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号源。SHG一般是非* *振动过程，光子在生物样品中只是非线性散射，不会被吸收，所以不会有伴随的光化学过程，可以减少对生物样品的损伤。SHG成像不需要染色，可以避免使用染料带来的光毒性。由于其在生物活体样品的无损测量或长期动态观察方面的独特应用价值，在生命科学研究领域越来越受到重视[17]。
3表面高分辨率显微镜
表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量而只能用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微镜、全内反射荧光显微镜、表面等离子体共振显微镜等。
3.1近场扫描光学显微镜(NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。因为光源与样品之间的距离接近纳米级，所以分辨率由光学探针的直径和探针与样品之间的距离决定，与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]通过控制在某一针尖振动频率下采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的信噪比，每秒可以快速测量100幅图像[19]。NSOM已被用于细胞膜上的单荧光团成像和光谱分析。
3.2全内反射荧光显微镜在绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(TIRF)技术得到了更多的关注和应用。通过使用特殊样品光学照明装置，TIRF可以提供高的轴向分辨率。当样品附着在靠近棱镜的盖玻片上时，随着全内反射的出现，避免了光对生物样品的直接照射。但由于波动效应，仍会有少量的能量穿过载玻片与液体介质的界面照射样品，这些光线的亮度足以在载玻片附近的薄层中形成100nm的光隐藏区，并激发这个浅层中的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获得，以获得接近100nm的高轴向分辨率。TIRF最近结合干涉照明技术应用于分子运动步态动力学的研究领域，分辨率为8nm，时间分辨率为100μs[21]。
3.3表面等离子体共振* * *表面等离子体共振(SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面上时，就会发生全反射，反射光的强度在各个角度都应该是相同的。但如果在介质表面镀上金属膜，入射光会耦合成表面等离子体激元，引起电子大幅振动，导致反射光在一定角度内大幅减弱，反射光完全消失的角度称为* * *振动角。* * *振动角度会随着在金属薄膜表面流动的液体的折射率而变化，折射率的变化与结合在金属表面的生物分子的质量成正比。通过测量涂层表面折射光强度的变化，可以得到表面折射率的微小变化。
自Fagerstan等人在1992中将其用于生物特异性相互作用分析以来，SPR技术已被应用于DNA-DNA生物特异性相互作用分析和检测、微生物细胞监测、蛋白质折叠机制研究以及细菌毒素对糖脂受体的亲和力和特异性的定量分析[23]。当SPR信息通过纳米尺度的小孔[24]传递，提供优异的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，有可能开发出全新的成像原理显微镜。
参考
【1】唐乐民，丁飞。生物科学中的图像处理与分析[M]。北京:科学出版社，2005: 205。
[2]卡姆·Z，汉瑟·B，古斯塔夫松·MGL，等.用于活体三维生物成像的计算自适应光学[J].美国国家科学院院刊，2001，98:3790-3795。
[3]布斯·MJ，尼尔·MAA，朱斯凯蒂斯R，等.共焦显微镜中的自适应像差校正[J].美国国家科学院学报，2002年，99:5788-5792。
[4]戈德曼路，斯佩克特路。活细胞成像实验室手册[J]。金泉港实验室出版社，2005年。
[5]蒙韦尔，斯卡丰，卡尔维兹，等.三维深部生物成像的图像自适应反卷积[J].生物物理学，2003，85:3991-4001。
[6]，郭，，瞿。三维荧光反体积。