如何分析微生物群落结构和多样性
按时间顺序，微生物群落结构和多样性分析技术的发展可以分为三个阶段。20世纪70年代以前，主要依靠传统的培养和分离方法，通过形态学、培养特性和生理生化特性的比较进行分类、鉴定和计数。对环境微生物群落结构和多样性的了解不够全面和有选择性，方法的分辨率较低。20世纪七八十年代，研究人员通过分析微生物的化学组成，总结出一些规律性的结论，建立了一些微生物分类和定量的方法，即生物标志物法，使对环境微生物群落结构和多样性的认识进入了一个更加客观的层面。20世纪80、90年代，现代分子生物学技术以DNA为靶标，通过rRNA基因测序和基因指纹图谱的方法，准确揭示了微生物的种类和遗传多样性，给出了关于群落结构的直观信息。
1传统文化和分离方法
传统的培养分离法是最早了解微生物群落结构和多样性的方法，自1880发明以来。
至今仍被广泛使用。传统的培养分离方法是将定量的样品接种到培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后统计计算生长菌落的含量，通过在显微镜下观察其形态结构，观察培养分离过程中的生理生化特征来鉴定种属分类特征。培养分离方法采用简单的营养基质和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响。这种人工环境与原生境的偏离，大大减少了可培养的种类(仅占环境微生物总数的0.1% ~ 10%[1])。而且这种方法繁琐费时，不能用于监测种群结构的动态变化。
2社区水平生理指纹法(CLPP)
一般认为微生物中所含的酶与其丰度或活性密切相关。酶分子对催化的生化反应具有高度特异性，不同的酶参与不同的生化反应。如果一个微生物群落中含有能催化利用特定底物的特定酶，这个酶-底物就可以作为这个群落的生物标志物之一，标志着某个群体的存在。Garlan和Mills[2]在1991中提出的群落水平生理指纹(CLPP)是一种酶活性分析方法，通过检测微生物样品的底物利用模式来反映种群的组成。具体来说，CLPP分析法是通过检测微生物样品对多种不同单一碳源底物的利用能力，来确定哪些底物可以作为能源，从而生成底物利用的生理代谢指纹。BIOLOG公司开发的BIOLOG氧化还原技术使CLPP方法快速方便。BIOLOG微孔板在市场上有两种类型:GN和MT，它们都含有96个孔，每个孔
128生态环境卷14No。1(65438+2005年10月)
微孔板干膜含有培养基和氧化还原染料四唑[3]。其中，BIOLOG的GN微孔板包含95种不同的碳源和一个无碳源的对照孔，而MT微孔板仅包含培养基和氧化还原染料，允许自由检测不同的碳源底物[3]。检测方法是:将处理后的微生物样品加入每个微孔中，在一定温度下孵育一定时间(一般为12 h)。在孵育过程中，氧化还原染料被呼吸途径产生的NADH还原，颜色变化的速率取决于呼吸速率。最后检测某一波长的吸光度，分析能源碳的利用类型和利用程度[4]。
BIOLOG方法可以有效评价土壤和其他环境菌群的微生物群落结构[3~6]。其优点是操作相对简单快捷，少量碳源就能区分出碳利用方式的差异[5]。然而，BIOLOG系统只能识别快速生长的微生物。此外，测试盘中近中性的缓冲体系、高浓度的碳源和生物毒性指示剂红色四氮唑(TTC)进一步增加了测试结果的误差。姚的研究表明，BIOLOG系统应根据测试对象的特性(如pH、碳源利用类型、利用能力等)进行改进，需要研究更好的指标来替代的使用。
3生物标记法
生物标志物通常是微生物细胞的生化成分，其总量通常与相应的生物量呈正相关。因为特定的结构标记物标记了特定类型的微生物，所以一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可以作为指纹来评价微生物群落结构。由于分类是基于从混合微生物群落中提取的生化成分，潜在地包括所有物种，因此具有一定的客观性。适用于微生物体系动态变化的定性甚至半定量检测。自20世纪80年代以来，常用于研究微生物群落结构的生物标志物方法包括醌类图谱和脂肪酸图谱(PLFAs和WCFA-FAMEs)。在测定过程中，用合适的提取剂从环境微生物样品中提取和纯化这些化合物，然后用合适的溶剂制成合适的样品，供GC或LC检测。最后，用统计学方法对得到的生物标志物谱进行定性和定量分析。
3.1醌类分析
呼吸醌广泛存在于微生物的细胞膜中，是细胞膜的组成成分，在电子传递链中起着重要的作用[7]。醌的含量与土壤和活性污泥生物量之间良好的线性关系研究表明，醌的含量可以作为微生物生物量的标志[8]。有两种主要类型的呼吸醌:泛醌，UQ)即辅酶Q和甲萘醌(MK)即维生素K[9]。根据侧链和侧链中含异戊二烯单元的数量，醌可以在分子结构(UQ和MK)的基础上被双键饱和
氢原子的数量被进一步区分。研究表明，每种微生物都含有一种优势醌类[7]，不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌类[9]。因此，醌的多样性可以定量表征微生物的多样性，醌谱的变化(即醌指纹)可以表征群落结构的变化。
醌指纹图谱用于描述微生物群落的参数[7]为:(1)醌类的种类和不同种类醌的数量；(2)优势醌及其摩尔分数；(3)总泛醌与总甲基萘醌的比率；(4)醌类的多样性和均匀性；(5)醌的总量等。对于两个不同的群落，从上述分析得到的数据可以计算出另一个参数_ _(相异度指数，D)，可以用来定量比较两个群落的结构差异。
醌指纹法简单快速，近年来被广泛应用于各种环境微生物样品(如土壤、活性污泥等水生环境群落)的分析。
考察了醌指纹法在活性污泥群落分析中的准确性，证明该方法是一种可靠的分析方法。但醌指纹法也有一定的局限性，不能反映具体属或种的变化。3.2脂肪酸谱法(PLFAs、PLFAs法梅斯和其他方法)
从微生物细胞中提取的脂肪生化成分是生物质的重要生物标志物，例如极性脂质(磷脂)和中性脂质(甘油二酯)可分别作为活性和非活性生物质的标记[10]。更重要的是，脂质分解产物_ _ _ _分子结构不同的混合长链脂肪酸的提取隐含了微生物的类型信息，其组成模式可以作为种群组成的标志。脂肪酸谱法广泛用于土壤、堆肥和水环境中微生物群落结构的分型和动态监测[11~13]。
常用的脂肪酸谱图可分为两种:磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图和全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-法梅斯)谱图[14]。两者本质上都是脂肪酸甲酯，区别在于脂肪酸的来源不同。磷脂脂肪酸(PLFAs)光谱法提取的脂肪酸主要来源于微生物细胞膜磷脂，即活细胞，全细胞脂肪酸甲酯(PLFAs法梅斯)光谱法提取的脂肪酸来源于环境微生物样品中所有甲基化脂质，即所有细胞(包括活细胞和死细胞)。因此，磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图的优点是准确可靠。全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-法梅斯)谱图法的优点是提取简单，样品用量少。对于多种环境微生物样品的分析，采用PLFAs法姆斯谱图进行预筛选，再用PLFAs法进行分析，是提高效率的较好选择。
脂肪酸谱的分析包括两种形式:一种是脂肪酸，用GC分析仪分离不同结构的分子；另一种是脂肪酸甲酯，脂肪酸甲基化的产物。用GC-MS分析仪对不同的分子进行了分离和鉴定。