蛋白质的表达和纯化
在pET载体中，在强转录和翻译信号的控制下，将目的基因克隆到T7噬菌体中，并通过在宿主细胞中提供T7 RNA聚合酶来诱导其表达。Novagen的宠物系统不断扩展，为表达提供了新的技术和选择。目前，* * *包括36种载体类型，15种不同的宿主菌和许多其他相关产品，旨在有效检测和纯化目标蛋白。
优势
它是最常被引用的表达原核蛋白的系统。
在任何大肠杆菌表达系统中，基本表达水平都是最低的。
真正的“变阻器”控制，以调整表达水平
提供多种不同融合标签和表达系统配置。
用于可溶性蛋白质生产、二硫键形成、蛋白质运输和多肽生产的特殊载体和宿主细菌。
许多载体在LIC载体试剂盒中提供，用于PCR产物的快速定向克隆。
许多宿主菌株是以感受态细胞的形式提供的，可以立即用于转化。
正向pFORCE TM克隆系统具有高效克隆PCR产物、正向选择重组体和高效表达目的蛋白的特点。
pET系统概述
PET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最有效的系统。根据Studier等人最初开发的T7启动子驱动系统，Novagen的pET系统已被用于表达数千种不同的蛋白质。
控制基本表达水平
PET系统提供了六种载体-宿主菌组合，可以通过调整基础表达水平来优化目的基因的表达。没有适用于所有靶蛋白的单一策略或条件，因此有必要优化选择。
宿主菌株
质粒在非表达宿主菌中构建后，通常用T7 RNA聚合酶基因转化宿主菌(λ DE3溶菌酶)表达目的蛋白。在λ DE3溶菌酶中，T7 RNA聚合酶基因由lacUV5启动子控制。在不被诱导的情况下有一定程度的转录，因此适合表达某些基因，其产物对宿主细胞的生长没有毒性作用。但当宿主菌携带pLysS和pLyE时，规定会更严格。PLys质粒编码T7溶菌酶，T7溶菌酶是T7 RNA聚合酶的天然抑制剂，因此降低了其在未诱导细胞中转录靶基因的能力。PLysS宿主菌产T7溶菌酶量低，而Plyss宿主菌产酶量多，因此是控制最严密的λ DE3溶菌酶。
有11种不同的DE3溶源性宿主细菌。BL21及其衍生菌株应用广泛，其优点是缺乏lon和ompT蛋白酶。菌株B834是甲硫氨酸营养缺陷型，因此35 S-甲硫氨酸和硒蛋氨酸可以用来标记比活性高的目的蛋白。BLR是一种recA衍生的菌株，它提高了质粒单体的产量，并有助于稳定含有重复序列的靶质粒。两个硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变菌株(AD494，BL21 trxB)有利于大肠杆菌细胞质中二硫键的形成。Origami TM和OrigamiB菌株是trxB/gor的双突变，这两种酶是主要还原途径中的关键酶。Origami和OrigamiB宿主菌的主要优势是可以形成含有二硫键的正确折叠的蛋白质。新Rosetta TM菌株补充了大肠杆菌4个稀有密码子的tRNA，改善了部分真核蛋白质因密码子使用频率不同而导致的低表达。其他菌株包括K-12 HMS174和NovaBlue，它们是recA样BLR。这些菌株能稳定表达某些目的基因，其产物可能导致DE3噬菌体的丢失。由于F-appender编码的高亲和力lacIq阻遏蛋白，NovaBlue是一种有用的紧密宿主菌株。此外，Novagen还提供了λ DE3溶源试剂盒，用于制备具有其他遗传背景的新表达宿主菌。另一种表达高毒性基因或制备新λ DE3溶酶体的替代方法是通过l CE6感染提供T7 RNA聚合酶。尽管这不如通过IPTG诱导λ DE3溶菌酶方便，但这种策略在一些应用中也是优选的。
高严格T7 lac启动子
除了在宿主细菌水平上选择三种基本表达严格性之外，pET系统中的T7启动子本身提供了两种不同的严格性选择:普通T7启动子和T7 lac启动子。T7 lac启动子在启动子区域下游17bp处包含一个25bp的lac操作序列。lac阻遏蛋白在该位点的结合可以有效地降低T7 RNA聚合酶的转录，这提供了第二种基于lacI的机制(除了lacUV5)来抑制λ DE3溶菌酶中的基本表达。含有T7 lac启动子的PET质粒也具有它们自己的lacI，这确保足够的阻遏蛋白结合到操作基因位点。
在实际应用中，为了获得最高的蛋白质产量，通常需要测试各种不同的载体/宿主细菌组合。
控制诱导表达水平
在许多情况下，具有最佳活性和溶解性的蛋白质的表达取决于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体构型。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。pET系统除了根据载体和宿主菌的组合来控制T7 RNA聚合酶的基本表达外，还根据诱导物(IPTG)的浓度为目的蛋白的表达提供了真正的“变阻器”控制。调谐器和OrigamiB宿主细菌的LacY突变使这种控制成为可能。
选择宠物承运人
所有的pET载体都来自pBR322，但是它们在前导序列、表达信号、融合标签、相关的限制性位点和其他特性上是不同的。有两种类型的pET质粒，即转录载体和翻译载体:
转录载体(包括pET-21、pET-23和pET-24)表达靶RNA，但不提供翻译信号。它们用于表达带有细菌翻译信号的靶基因的蛋白质。(注:转录载体通过名称后缺少的字母后缀来区分。)
翻译载体包含为蛋白质表达设计的有效翻译起始信号。许多载体在阅读框A、B和C都有克隆位点，分别对应于BamH I位点的GGA、GAT和ATC三联体。
选择关键点
选择用于表达的pET载体通常涉及许多因素。考虑以下三个主要因素:
表达的蛋白质的用途
表达蛋白质的已知信息
克隆策略
pET载体表达的蛋白质具有多种用途。例如，具有分析表达水平的蛋白质可用于活性研究、突变体筛选和表征、配体相互作用筛选和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析蛋白，但只有当载体、宿主菌和培养条件的组合非常合适时，才能用于大量纯化。如果需要活性蛋白的持续高产，应测试载体、宿主细菌和培养条件的各种组合，以找到最佳结果。
关于目标蛋白的任何已知信息都有助于载体的选择。例如，某些蛋白质的活性要求一端或两端没有外源序列。许多pET载体可以克隆非融合序列。然而，如果特定的翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效使用，表达水平可能会受到影响。在这些情况下，融合蛋白通常可以用有效表达的氨基末端序列构建，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化融合序列。LIC(连接非依赖性克隆)策略对该方法特别有用，因为克隆操作可以通过肠激酶和因子Xa去除所有氨基末端载体编码序列。
由于限制性位点和阅读框的兼容性，克隆策略也会影响载体的选择。因为许多pET载体具有相同的限制性位点构型，所以通常可以将一次制备的靶基因克隆到几个载体中。采用PCR克隆策略时有不同的考虑。为此，推荐使用LIC载体试剂盒。插入物可以通过PCR制备，无需限制性消化载体或插入物。
溶解性和细胞定位
考虑到目的蛋白的应用和克隆策略，确定目的蛋白的细胞定位和可溶性是非常重要的。在许多实际应用中，经常需要表达可溶性活性蛋白。
特定目标蛋白质的溶解性取决于许多因素，包括它们各自的蛋白质序列。在许多情况下，溶解性不是存在或不存在的现象，载体、宿主细菌和培养条件可用于增加或减少获得的可溶或不溶形式的比例。PET-32载体系列将靶序列与硫氧还蛋白(Trx)融合。Tag)，通常可以增加可溶性蛋白的比例。新推出的pET-43.1系列有一个融合伙伴——Nus。Tag，一种过量表达时具有高溶解性的大肠杆菌蛋白，通过大量系统筛选获得，从而进一步提高了目的蛋白的溶解性。此外，trxB突变体AD494和BL21 trxB，或trxB/gor origamit和OrigamiB菌株可用于形成细胞质中许多真核蛋白质的正确折叠和活性所需的二硫键。低温诱导(15-25℃)也能提高可溶性目的蛋白的比例。
获得可溶性活性蛋白的另一种策略是将蛋白分泌到细胞外周质中，这为折叠和二硫键形成提供了更合适的环境。为了达到这个目的，通常使用带有信号肽的载体。
一些纯化策略可以优化细胞质中不溶性包涵体的产量。包涵体被提取溶解，然后目的蛋白在体外重折叠(例如使用Novagen的蛋白折叠试剂盒)。该过程通常产生高产量的初始蛋白质，并防止宿主细胞中的蛋白质降解。然而，重折叠成活性蛋白质的效率随不同的蛋白质而变化很大，并且可能相当低。PET-31b (+)载体是专门为生产不溶性融合蛋白而设计的，为生产小蛋白和多肽提供了一种有效的方法。
满足不同需求的融合标签
如果融合序列不影响应用，生产融合蛋白用S.Tag，T7。标签a，他的。标签a和HSV。Tag a会方便后续操作，容易通过蛋白杂交检测。这些肽(融合序列很小)，它们的检测试剂是极其特异和灵敏的。商品服务税。标签、S标签和T7。通过使用相应的树脂和缓冲液试剂盒，标签序列可用于亲和纯化。
通过使用S.Tag和GST，可以准确地定量粗制或纯化的融合蛋白。标签分析套件。具有新型底物的FRETWorks S.Tag检测试剂盒可以通过荧光检测小于1fmol的融合蛋白。
他的。Tag a序列作为纯化蛋白的融合伴侣是非常有用的，特别是对于那些以包涵体形式表达的蛋白，它可以在溶解蛋白完全变性的条件下使亲和纯化成为可能。
CBD。标签a在低成本亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重折叠(尤其是pET-34b (+)和35b (+)与CBD clos。标记一个序列)。因为只有正确重折叠的CBD才与纤维素基质结合，所以CBIND亲和纯化步骤可以从制备物中除去不正确折叠的分子。任何标签都可以用于固定目标蛋白，但它更适合于此目的，因为它与纤维素基质的非特异性结合和生物相容性较低。
国大。标签，Trx。标签和GST。标签序列用于增加其融合配偶体的溶解性。国大。标签和事务处理。标签载体与折纸宿主细菌相容，有利于细胞质中二硫键的形成。
请参见各种fusion标签和相应的宠物载运器列表。一些宠物携带者携带几个* * *融合标签作为5’融合伴侣。此外，许多载体通过目的基因序列的阅读框架表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在5’标签和靶序列之间含有蛋白酶切割位点(凝血酶、因子Xa和肠激酶)的载体，可以在纯化后选择性除去一个或多个标签。PET-30 Ek/LIC、pET-32 Ek/LIC、pET-34 Ek/LIC和pET-36 Ek/LIC是细胞定位和亲和标签配置的良好代表。pET Ek/LIC载体组合试剂盒包括所有四种即用型载体，可直接用于构建几种靶基因构型。
PET NusA融合系统43.1
在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白
新引入的pET NusA融合系统被设计用于克隆和高水平表达与495aa NusA (Nus)融合的多肽序列。标签)蛋白质。基于数据库中超过4000种蛋白质的溶解度建模，NusA蛋白质被证实具有最高的溶解度。在用四种不同的NusA融合蛋白进行的实验中，超过85%的表达蛋白是可溶的。PET-43.1载体含有Nus。Tag融合伴侣，并兼容trx/gor突变体Origami和OrigamiB，有利于细胞质内二硫键的形成。使用pET-43.1载体和这些trx/gor宿主细菌的组合，有可能获得二硫键结合的蛋白质。
优势
高度可溶的N端Nus。标签融合伙伴
他的上游。标签a、S .标签和可选的c端HSV。标签a，他的。标签融合标签。
凝血酶和肠激酶切割位点
多克隆位点位于所有阅读框中。
与AD494和Origami宿主菌株兼容，可促进表达蛋白的正确折叠。
宠物宿主菌株感受态细胞
pET系统的所有宿主菌均以预先检测的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。
(DE3)表示宿主是λ DE3溶菌酶，其染色体上有一个由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因拷贝。这种菌株适合于从克隆到pET载体中的目的基因生产蛋白质。命名为pLysS和pLysE的宿主细菌携带编码T7溶菌酶的pET兼容质粒，T7溶菌酶是T7 RNA聚合酶的天然抑制剂。具有pLysS的细胞产生少量的溶菌酶，而pLysE宿主细菌产生大量的酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7 RNA聚合酶的基本表达，这可以稳定编码影响细胞生长和活力的靶蛋白的pET重组体。带有pLacI的宿主细菌产生额外的lac阻遏蛋白，抑制pETBlue和pTriEx载体的基本表达。λ DE3溶源试剂盒用于制备其他遗传背景的新表达宿主菌。
AD494菌株是硫氧还蛋白还原酶(trxB)的突变菌株，它可以在细胞质中形成二硫键，为产生正确折叠的活性蛋白提供了潜力。TrxB突变可以被卡那霉素选择，因此推荐该菌株用于带有氨苄青霉素抗性标记bla的质粒。
B834是BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌是甲硫氨酸缺陷的，目的蛋白可以用35 S-甲硫氨酸和高比活的硒蛋氨酸标记，可用于晶体学研究。
BL21，最广泛使用的宿主细菌来源，具有缺乏lon和ompT蛋白酶的优点。
菌株BL21 TrxB在蛋白酶缺乏BL21的背景下，具有与菌株AD494相同的硫氧还蛋白还原酶突变(TrxB)。由于trxB宿主有利于细胞质中二硫键的形成，因此使用它们可以增加正确折叠的蛋白质成分。TrxB突变可以被卡那霉素选择，因此推荐该菌株用于带有氨苄青霉素抗性标记bla的质粒。
具有BL21的BLR的RecA衍生菌株可以提高质粒单体的产量，并有助于稳定含有重复序列或其产物的靶质粒，所述重复序列或其产物会导致DE3噬菌体丢失。
HMS174菌株在K-12背景上提供了recA突变。像BLR一样，这些菌株可以稳定一些靶基因，其产物可以导致DE3噬菌体丢失。
NovaBlue适合K-12菌株作为初始克隆宿主菌株，具有高转化效率、蓝/白斑筛选能力(具有合适的质粒)和recA endA突变导致高产量的高质量质粒DNA。NovaBlue的DE3溶菌酶是一种非常有用的紧密宿主菌株，因为存在由F-attach编码的lacI q阻遏蛋白。
Origami是来源于K-12的宿主菌株。硫氧还蛋白还原酶突变(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)基因都是突变，可以大大增强细胞质中二硫键的形成。研究表明，即使整体表达水平相近，Origami (DE3)表达的活性蛋白也比其他宿主菌高10倍。Origami宿主菌株与氨苄青霉素抗性质粒相容，可用作pET-32载体。硫氧还蛋白标记可以进一步增强细胞质中二硫键的形成。TrxB和gor突变可分别被卡那霉素和四环素选择，因此该菌株被推荐用于具有氨苄青霉素抗性标记bla的pET质粒。
Origami B宿主菌株来源于BL21 lacZY突变体，具有与原始Origami菌株相同的TrxB/gor突变。Origami B菌株综合了BL21、Tuner和Origami宿主菌株的优点。TrxB和gor突变可分别被卡那霉素和四环素选择，因此该菌株被推荐用于具有氨苄青霉素抗性标记bla的pET质粒。
Rosetta宿主菌株来源于BL21，能增强大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白质的表达。该菌株用相容的氯霉素抗性质粒补充了密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样，Rosetta菌株提供了“通用”翻译，从而避免了大肠杆菌密码子使用频率引起的表达限制。TRNA基因由其天然启动子驱动。在Rosetta (DE3) pLysS和Rosetta (DE3) pLacI中，罕见的tRNA基因分别与T7溶菌酶和lac阻遏物基因存在于同一质粒上。
Tuner菌株是BL21的lacZY缺失突变体，可以调节培养物中所有细胞的蛋白质表达水平。Lac通透酶(lacY)突变使IPTG均匀进入群体的所有细胞，因此具有浓度依赖性和均匀诱导表达。通过调节IPTG浓度，可以将表达从非常低的水平调节到非常强的和完全诱导的表达水平(通常与pET载体相关)。低水平表达有时可以增强难以表达的蛋白质的溶解性和活性。Tuner (DE3) pLacI菌株与pETBlue和pTriEx载体的表达相容。
重组蛋白的纯化
/实验/蛋白质4/86143.shtml