病原微生物免疫诊断技术综述

摘要:病原微生物种类繁多，变异迅速，快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展。目前广泛应用的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因芯片、聚合酶链反应等。本文综述了这些检测技术的进展。对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体，包括病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊病毒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来，SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病传染性极强，经常引起世界性大流行，因此对病原体的检测必须快速、准确。常规的病原体检测方法操作复杂，检测周期长，对操作人员的技术要求高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原体诊断不再局限于病原体水平，深入分子水平和基因水平的检测方法不断涌现并应用于临床和实验室。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等检测方法自动化程度高，快速、省时、无污染、准确，能准确、灵敏地鉴定病原微生物。1病原微生物的传统检测方法病原微生物的传统实验室检验主要以染色、培养和生化鉴定为主。标本的直接涂片染色和镜检以及接种在培养基上进行分离培养是细菌或真菌感染性疾病病原学诊断的常用方法。1.1直接涂片镜检，病原微生物体积微小，多为无色半透明，染色后显微镜下可观察到其大小、形状和排列。直接涂片染色镜检法简单、快速，对于那些特殊形式的病原微生物感染，如淋球菌感染、结核分枝杆菌感染、螺旋体感染等，仍然适用。直接涂片镜检不需要特殊的仪器设备，仍然是基层实验室检测病原微生物非常重要的手段。1.2分离培养和生化反应分离培养主要用于临床标本(如血液、痰液、粪便等)中存在多种细菌时，分离出某一种细菌。)或文化。细菌生长繁殖需要一段时间，检测周期长，无法同时处理批量样本。为了解决这个问题，各种自动培养识别系统不断产生，传统的识别方法也逐渐改进，大大加快了检验速度。比如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪，可以同时做细菌鉴定和药敏试验，检测500多个菌株。肥大性细菌如肺炎链球菌、淋球菌、流感嗜血杆菌等。要求营养较高，常规培养阳性率低。永刚等人在巧克力培养基中添加不同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊接种剂，制成新的淋球菌培养基，大大提高了淋球菌的分离培养率。苏圣通等人在营养琼脂中添加中药大枣、赤小豆，培养出A链球菌、B链球菌、肺炎链球菌等细菌，生长指数明显高于血平板。1.3组织细胞培养活组织细胞培养适用于处理生活在活组织细胞中的病原体，包括病毒、立克次体、衣原体等。不同的病原体敏感组织细胞是不同的。从病原体敏感的动物组织中取出活细胞进行体外原代培养或与病原体敏感的细胞系传代培养，然后将病原体接种到相应的组织细胞中，病原体可在其中繁殖生长，产生特定的细胞病变效应。病原体也可以直接接种到敏感动物体内，引起相应组织器官的特定病变。通常可以根据这些特定的损伤来识别病原体。2血清学和免疫学检测血清学检测是用已知的抗体或抗原检测病原体的抗原或抗体，从而快速鉴定病原体的技术，简化了鉴定步骤。常用的方法有血清凝集技术、乳胶凝集试验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验和酶联免疫吸附试验。酶联免疫吸附试验的应用大大提高了血清学检测的灵敏度和特异性，不仅可以检测样本中的病原体抗原，还可以检测机体的抗体成分。幽门螺杆菌在中国人群中的感染率高达50% ~ 80%。用酶联免疫吸附试验检测唾液中抗HP抗体诊断HP感染，结果令人满意。我国乙肝病毒(HBV)感染率极高，ELISA在乙肝患者早期血清学诊断中的作用最为明显。临床上病原菌往往与非病原菌混杂，如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来在微生物检测领域发展起来的一项新技术。其基本原理是将特定病原体的单克隆抗体或多克隆抗体或二抗偶联到磁珠微球上，通过抗原抗体反应形成磁珠-靶病原体复合物或磁珠-靶病原体复合物，在外加磁场的作用下分离靶病原体。目前已针对各种病原体开发出免疫磁珠，如大肠杆菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等，广泛应用于各级科研和实验室。IMBS分离的白色念珠菌可在显微镜下直接检测，检测时间缩短至4小时。IM-BS还可与其他检测技术结合检测致病菌，利用免疫磁珠分离的目标菌进行分离培养，将大肠杆菌0157的最低检测限从200 cfu g提高到2 cfu g ~；IMBS结合聚合酶链反应(IMBS-PCR)可以快速检测特殊培养条件下的细菌，如苛求菌和厌氧菌。imbs-PCR将肉中产气荚膜梭菌的检测时间缩短至10 h，最低检测限可达10cfu g~ ~。一些研究人员使用imbs结合实时荧光定量PCR (imbs-PCR)。Leon—Velarde等人利用IMB8结合酶联检测，大大提高了沙门氏菌的检测效率。3基因检测随着科技的发展，分子生物学检测技术日新月异。病原微生物的鉴定不再局限于普通的外部形态结构和生理生化特征的一般检查，而是深入到分子水平和核酸水平。病原微生物的核酸序列，即基因片段，都具有特异性，区别于其他种或属。检测它们独特的基因片段序列可用于鉴定病原微生物。随着科学技术的发展，基因检测技术逐渐取代其他检测技术，成为临床实验室和基础实验室病原体检测的主流技术。3.1核酸杂交技术具有一定互补序列的单核苷酸链根据碱基互补配对原理在液相或固相中形成异源双链的过程称为核酸杂交，杂交的双方是使用的探针和待测核酸。在病原微生物的检测中，核酸分子杂交主要包括两种:膜印迹杂交和核酸原位杂交。膜上印迹杂交是指将核酸从微生物细胞中分离出来，在体外纯化并结合到某种固相支持物上，与液相中存在的标记核酸探针杂交。核酸原位杂交是指标记的核酸探针直接与细胞或组织切片中的核酸杂交。还可以用荧光标记探针，在荧光显微镜或激光扫描聚焦显微镜下鉴定病原体，还可以显示在三维空间中的位置。与其他方法相比，核酸分子杂交检测技术具有简单、灵敏、快速和特异的明显优势。Wong等人用两种不同的荧光标记的寡核苷酸探针从血样中检测假单胞菌和不动杆菌。最低检测限为10 cfu mL~ ~，特异性为100%，检测时间小于2 h..寡核苷酸探针是针对病原体特异性基因序列设计的，可以在不同的分类水平上定位待检测的病原体，如科、属、种和亚种。(病原微生物检测技术进展)3.2基因芯片技术(DNA chip)又称DNA微阵列或DNA芯片，是生物芯片的一种J，是核酸分子杂交技术的延伸。通过微机械加工技术，将数万甚至数百万个基因探针，即DNA片段，有规律地排列成二维DNA探针阵列，固定在硅片、载玻片等固体支持物上，与标记的样品分子杂交，进行基因检测。其测序原理与核酸杂交相同，但解决了传统核酸杂交技术操作复杂、检测效率低、自动化程度低等缺点。基因芯片在病原微生物感染诊断中的应用，大大缩短了诊断所需的时间，可以检测出病原体是否有耐药性，对那些抗生素有耐药性，对那些抗生素敏感。Naas设计的基因芯片可以检测铜绿假单胞菌、肠杆菌和博德特氏菌中的各种B-内酰胺酶耐药基因。蔡婷等人设计的基因芯片检测大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌对l7种抗菌药物的耐药率。Batchelor等人开发的基因芯片可以检测编码扩展谱8等47种耐药基因的大肠杆菌和沙门氏菌。内酰胺酶类、磺胺类、四环素类和氨基糖苷类。基因芯片技术也有一些问题需要解决，如提高芯片的特异性和检测信号的灵敏度，降低芯片的制造成本，大部分芯片需要昂贵的检测仪器。这些问题使得基因芯片主要局限于实验室研究，没有广泛应用于临床病原微生物的检测和鉴定。(病原微生物检测技术进展)3.3 PCR技术聚合酶链反应(PCR)是利用已知的寡核苷酸引物，在体外未知片段中引导并扩增少量待检测基因片段的技术。由于PCR可以扩增待检测的基因，特别适用于病原体感染的早期诊断，但如果引物的特异性不强，可能会造成假阳性。PCR技术近20年发展迅速，从基因扩增到基因克隆转化和遗传分析，其可靠性逐渐提高。Jbara通过PCR和传统方法在75份样本中直接检测出流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌。与传统方法相比，PCR检测的特异性和敏感性分别为87.3%和100%。在1988中，Chamberian等人提出了多重PCR的概念。在同一个PCR反应体系中加入两对以上的引物，可以同时扩增多个核酸片段，适用于大量样品的分析鉴定。多重PCR具有以下优点:(1)效率高，可在同一反应体系中同时检测多种病原微生物，或对同一病原微生物的不同类型进行分型；(2)系统和多重PCR非常适合检测群体病原体，如几种肝炎病毒同时感染；多种性病病原体感染，如淋球菌、梅毒螺旋体和艾滋病毒；需要特殊培养的无芽孢厌氧菌感染；战伤引起的破伤风、炭疽、产气荚膜梭菌、鼠疫杆菌等细菌感染；(3)经济简单，可在同一反应管中同时检测多种病原体，节省试剂、成本和时间，为临床提供更快、更多、更准确的诊断信息。Reyes等用多重PCR从90例发热但培养阴性的患儿脑脊液标本中检测出脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，特异性为100%，敏感性为89%。实时荧光定量PCR，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR过程。具有高灵敏度、高特异性、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时荧光定量PCR对性病的早期诊断、窗口期筛查、疗效检测、基因变异分析和预后评估具有重要价值，有助于流行病学调查。王恒等人建立了多重实时荧光定量PCR反应系统，同一系统可以同时快速检测耐甲氧西林和产肠毒素A金黄色葡萄球菌。标记有荧光基团的特异性引物能准确反映病原体感染和药物疗效，特别适用于病毒、衣原体等无法人工培养、难以培养的病原体的诊断。基因芯片技术与多重PCR相结合，通过PCR扩增目的基因，基因芯片的荧光探针增强了检测的灵敏度和特异性，使两种检测技术优势互补，已广泛应用于病原微生物的检测。以病原体特异性基因为靶基因设计引物和探针，通过多重PCR扩增制备寡核苷酸芯片。然后，通过多重PCR扩增待测样品的目的基因，扩增产物与病原体多重PCR基因芯片检测系统杂交，根据杂交信号可以直观地判读样品中所含病原体的种类、类型、毒力和侵袭力，从而对病原体进行检测和鉴定。(病原微生物检测技术进展)3.4其他基因检测技术分子生物学技术发展迅速，各种新的基因检测方法不断涌现。Notomi于2000年开发了一种新的环介导等温核酸扩增方法(1 OOP介导的DNA等温扩增，简称LAMP)。针对目标基因序列中的六个或八个特定区域设计四个或六个引物，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下形成环状结构和链置换，大量扩增目标DNA。短短几年间，LAMP已经广泛应用于疾病诊断、食品检验、环境监测、生物安全等方面。李蒙等用LAMP法对16例开放性伤口深部感染分泌物进行60 min破伤风梭菌检测，其中4例阳性，最低检测限为4×10。有报道用LAMP技术快速检测200份结核病人痰标本，结核分枝杆菌阳性检出率远高于培养法和染色法。MLVA(multi-locus variable-nun-Bertandem repeat analysis)是一种根据病原体基因组中可变数目串联重复序列的特征进行基因分型的技术，广泛应用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和炭疽杆菌的基因分型和鉴定。。总结与展望:快速准确地检测和鉴定病原体是传染病防治的首要问题。随着生物学研究从宏观领域向微观领域的发展，病原体的检测方法也从组织形态学水平深入到分子水平和基因水平。近年来，病原微生物高通定量检测技术具有样品需求少、快速省时、无污染、诊断结果准确、自动化程度高等优点。相信随着研究的不断进步和深入，这些高通定量诊断技术和方法将在病原微生物的诊断和分析中发挥越来越重要的作用，多种检测技术的结合和综合将具有广阔的应用前景。