罗氏454测序系统的测序流程

1.样品类型:GS FLX系统支持各种来源的样品测序，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、c DNA和小分子RNA等。不同类型的样品可以在一台仪器上进行测序。

2.样品DNA中断:基因组DNA或BAC等样品被中断成300 ~ 800 BP的片段；对于小的非编码RNA，不需要这一步。短的PCR产物可以用GS融合引物扩增，然后直接进行步骤4。

3.连接:通过一系列标准的分子生物学技术将在3’和5’末端具有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。接头也将用于随后的纯化、扩增和测序步骤。图中仅显示了在以下步骤中使用的单链DNA片段。

4.一个DNA片段=一个磁珠:接头将数百个DNA片段结合到一个磁珠上，磁珠包被单个油水混合液滴后，在这个液滴中独立扩增，不受其他竞争或污染序列的影响，从而实现所有DNA片段的平行扩增(emPCR)。

5.一个磁珠=一个阅读长度:emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段有上千个相同的拷贝。富集后，这些片段仍然与磁珠结合，然后可以放入微微量滴定板进行后续测序。

6.数据读取和分析工具:FLX GS

该系统提供了三种不同的生物信息学工具来分析测序数据，适用于不同的应用。比如多达3Gb序列的重测序，扩增产物与已知参考序列的差异分析，120Mb的从头测序工作等。

罗氏454测序系统是最早的新一代测序系统，其应用成果已在Nature和Science上发表多篇论文。454系统自推出以来已升级多次。最新的GS FLX序列分析仪结合钛系列测序试剂，测序通量更高(每反应400Mb)，灵活性和准确性更广，保持了新一代测序技术运行速度最快(3-5天)和单个序列阅读长度最高(400bp)的优势，单个阅读长度准确率可超过99.5%，全测序结果一致准确率大于99.5%。作为Titanium系列的新成员，长距离双端试剂盒可以对3-20kb的插入片段进行双端测序，突破了新一代测序技术中重复序列差的瓶颈。此外，拥有完整的软件包是GS FLX的一大特色，其简单易用的图形界面可用于绘制、拼接和检测扩增产物的差异。同时，由于其超高的测序阅读长度，GS FLX可以与传统的序列分析软件整合，这也是其他新一代测序技术无法做到的。由于其优异的性能，GS FLX系统可广泛用于全基因组从头测序和BAC文库重测序、扩增产物重测序、转录组分析、基因调控等基因组学研究。