【2020年春假】植物根系利用细胞损伤的“门控”机制调节自身免疫反应。
本文回答了这样一个问题:当拟南芥根系面临损伤和病原感染时，如何在单细胞水平上激活下游的免疫反应。
识别病原关联的分子模式对于植物免疫反应非常重要。这种复杂的传感系统不断暴露在微生物群体中，如何有效地将其应用于根部仍然是一个谜。通过在细胞水平观察拟南芥根中MAMP受体的表达模式和反应水平，我们观察到分化细胞的外层显示低水平的PRR(模式识别受体)表达，并且缺乏下游MAMP反应。然而，这些细胞可以通过邻近细胞的损伤做出反应。激光消融小细胞团可以强烈上调邻近细胞的PRR表达，增加的PRR水平足以引起无反应细胞的免疫反应。最后，局部损伤也可导致对非免疫原性有益菌的免疫反应。损伤门控被受体过表达所覆盖，使病原菌无法在根际定殖。我们的研究发现，细胞损伤可以“开启”局部免疫反应，这有助于理解细胞损伤是如何发生的。虽然土壤中有微生物的模式，但MAMP可以感觉到。
简单介绍了背景。比如PTI的标记过程，比如ROS的积累，MAPK的激活以及其他标记基因的表达。
材料:三重m金星融合到核定位信号(NLS-3xm金星)，一种荧光标记材料，可以在体内和细胞水平分析MAMP的反应。
Mammp反应标记基因:1。PER5(过氧化物酶5)，受早期MAMP诱导，在根中高表达；2.WRKY11 (WRKY DNA结合蛋白11)；3.MYB51(MYB结构域蛋白51)；4.FRK1 (FLG22诱导的受体样激酶1).
拟南芥根中flg22诱导的MAMP反应在空间上受到限制
从图1的ABC可以看出，在4个标记基因中，PER5和FRK1用flg22处理根后背景噪音更低，诱导性更好，MAMP反应的位置局限在分生组织和伸长区。对于分化的根部分，即使用高浓度的flg22处理也不能观察到MAMP的响应信号。(红色为PI染色，绿色为荧光信号)
为了准确评估特定细胞和细胞类型的信号，作者制备了两种标记物的遗传物质，另一种是组成型表达并靶向质膜的RFP。在长期的观察中，作者发现分化的根在flag22处理后表现出减弱的和空间有限的MAMP反应，而在侧根形成过程中，侧根原基附近的细胞由于侧根原基的弹射而被破坏。此时，当施用flg22时，侧根原基附近的细胞对MAMP处理表现出强烈的反应(1D，1F，蓝色箭头表示侧根原基。虚线圆圈表示侧根原基的形成，白色箭头表示MAMP反应。而且，当出现自发性和非诱导性细胞死亡(1E*)时，在邻近细胞中发现flg22诱导的MAMP反应，这种反应与受体(FLS2) (1G)有关。因此，分化的根具有响应MAMPs的能力，这是通过高度本地化的方式(侧根原基形成，自发细胞死亡)诱导的。
激光诱导的细胞消融引起根部局部MAMP反应
(F2A白色星号代表激光消融的细胞，所有这些细胞在分化的根、EP表皮、Co皮层、En内皮层和St中柱细胞中起作用)
在激光消融破坏了不同类型的根细胞后，我们只观察到邻近细胞中flg22反应的强烈增加。然而，对于消融的细胞本身，没有或很少诱导MAMP标记基因，这揭示了自身细胞的破坏不足以引起强烈的MAMP反应。在表皮、皮层和内皮层被消融后，中柱细胞对flag22的诱导反应强烈，但表皮细胞的消融并没有导致表皮附近的细胞对flag22 (F2AB)产生反应。
早先我们知道土壤中的有益微生物会在足跟的伸长区定殖。用高剂量(1um)的flg22处理延伸区(F1B)模拟了这一过程，可引起MAMP反应而不造成损伤。为了排除剂量效应，我们想知道低剂量(100nm)flg 22联合细胞消融是否会引起邻近细胞的MAMP反应。我们发现，在施加100nm的flag22后，在未受损的伸长区中仅观察到少量MAMP诱导的反应(F2CD)，但如果伸长区中的表皮细胞被破坏，则皮层细胞的MAMP反应增强，这与分化根的反应相似(F2ABCD)。因此，作者推测损伤引起的邻近细胞MAMP反应的增强可能发生在整个根中。
单独存在DAMPs不足以诱导MAMP反应
在这一点上，作者认为，是否可能是细胞损伤产生的阻尼导致了邻近细胞的MAMP反应？所以笔者选取了几个经典的DAMPs，如atpep 1、ATP、纤维二糖、OGS，以及以上四种DAMPs的混合物进行鸡尾酒处理。将每种DAMPs与flg22混合后，发现即使使用高浓度的DAMPs也不能诱导对flag22的强烈和持续的反应。[EZ出现荧光是因为高浓度(1um)的Flag22处理会引起MAMP反应，不需要细胞损伤]。ATPEP 1是个例外，它只能在DZ区引起微弱的FRK1反应，而不能引起PER5反应。这说明邻近细胞对损伤信号的感知比作者想象的更复杂，不是通过DAMPs，而是通过离子和渗透物的释放或其他机械压力。
MAMP受体的表达是由细胞消融诱导的，并且足以诱导反应性
作者发现，在FLS2过表达材料中，通过应用FLG202处理，可以在分化的外根细胞层中观察到FLG202的反应(F4A ),这暗示了由细胞损伤引起的邻近细胞的MAMP反应是否与PRR表达的增加有关。
我们发现，无论成熟区还是伸长区(F4，BDFG)，当根受损时，FLS2的转录水平被激活。而且FLS2在时间和空间上的上调程度与MAMP(FRK1和PER5)观察到的反应模式一致(F2ABCD与F4BCDF比较)。从F4E开始，在接受细胞损伤和应用flag22后，我们发现FLS2的局部表达水平增加。作者想知道FLS2的激活是否与MAMP反应有关，并发现当用相同的flag22和细胞损伤(F4HI)处理时，邻近MAMP反应的细胞与FLS2激活的细胞一致。这也表明细胞损伤诱导了PRR的高表达，并且足以引起MAMP反应。
凯氏带划分分化根中的flg22反应
(sgn3-3凯氏带缺失突变体，外来物质可以直接进入中柱鞘细胞。F5AB都是分化区)
FLS2在中柱鞘细胞中高度表达，但在sgn3-3的成熟区域，当应用FLG2时，没有观察到FLG2的反应。然而，在过量表达的FLS2材料中，在sgn3-3中观察到FLG2的反应，而在野生型中没有(F5AB，红色箭头表示中柱鞘细胞，由于凯氏带的阻碍，PI不能对其染色。这一结果表明，凯氏带可以划分免疫感知。在WT中，FLS2的量不能引起MAMP的反应，但强启动子可以(F5。AB第3列)。
木栓质片层干扰内皮层中flg22的感知
Sgn3: Kjeldahl带在延伸开始后的25细胞期是不连续的。
Esb1:延伸开始后25细胞期凯氏带不连续，内胚层提前栓塞。
ABA处理:内胚层提前栓塞。
凯氏带的作用是阻止外来物质进入中柱细胞，而内栓层(一种次生细胞壁修饰)最终包围整个内胚层，抑制内胚层的分子吸收，因为疏水的内栓层不允许来自细胞壁的分子进入内胚层的细胞膜(F5，CD)。
我们发现早期分化的内皮细胞(初始延伸后的25个细胞，无栓塞)在FLS2过表达材料中显示对flg22的反应，但晚期内皮细胞(初始延伸后的55个细胞，有栓塞)没有显示对flg22的反应。(F.5E，第2栏)在esb1和ABA处理的细胞中，flg22的反应在早期内胚层中受到抑制，这表明细胞受到过早栓塞的保护，并且FLS2不能与flg22结合(F.5E)。即使在根成熟区，表皮和皮层被破坏，也出现这种现象(FLS2因内胚层过早栓塞而与flg22分离)(F.5F)。
细胞损伤激活多种模式识别受体的表达
在完成一个受体的机理后，作者想扩展一下机理，然后发现了PRR、EFR、CERK1、RLP23三种。作者观察到，在细胞损伤的情况下，所有三种受体都上调表达，这表明细胞损伤介导了对MAMPs的非常常见的上调反应。(F6AB)
在整理完经典的LRR域受体之后，笔者想知道它是否还适用于非经典受体，比如LORE(脂寡糖特异性减少激发子)。同样，在早期分化的细胞被破坏后，LORE的表达被强烈诱导，其配体的应用也在延伸区主导了MAMP的反应，但在成熟区没有，这与flg22 (F6D)相似。这将这一机制扩展到其他prr。
根-细菌相互作用中的损伤对免疫反应的局部门控
刚才是细胞学测试，最终会落实到实际情况中。使用有益菌(CHA0)感染根，作者观察到尽管在根中有强的定殖，但在未受损的分化根中没有观察到MAMP反应。与细胞学实验类似，在侧根原基形成的相邻细胞中观察到MAMP反应(自发破坏)，FLS2过表达可引起MAMP反应而不损伤细胞(F7A)。当细菌感染与细胞消融相结合时，破坏位点附近的细胞在细菌存在下表现出对MAMP的反应(F7BC)。细菌提供多种配体
接下来作者用了对根际有害的细菌，GMI1000和GMI1000。最初的感染不会引起细胞破坏和强烈的MAMP反应，但持续感染会导致一些表皮细胞死亡。此时，可以在邻近细胞中观察到局部MAMP反应增加(F7D)。在FLS2过表达材料的成熟区域，flg22处理(F4A)和有益细菌感染(F7A)均显示MAMP反应和低细菌生长(F7A，E)。有趣的是，有害细菌GMI1000的鞭毛蛋白不能激活拟南芥的FLS2受体。
作者提出的模式图见F7F，不赘述。
给我的灵感
1.把实验做细，大框架已经搭建好，细节看成败。
2.多做近似等式，比如A=B，B=C，那么a = C。
3.实验的每一步都需要去做，不能偷懒，不能想当然。毕竟生物体这么复杂~