药学论文
目的:研究并建立吡咯类抗真菌制剂的微生物限度检查方法。方法:以含组氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液为稀释剂和洗涤液，采用离心沉淀法和薄膜过滤法对这些药物进行微生物限度检查，并进行方法学验证。结果:按照《中国药典》2005年版附录进行验证。结果表明，所有菌株的回收率均在70%以上，对照菌的阳性菌也生长良好。结论:采用含组氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作为稀释液和洗涤液，采用离心沉降和细菌收集法结合薄膜过滤法进行吡咯类抗真菌药物制剂的微生物限度检查是可行的。
[关键词]吡咯类抗真菌药物制备；微生物限度检查；离心细菌收集法；薄膜过滤法
吡咯类抗真菌剂，如硝酸戊唑醇和克霉唑，具有广谱抗真菌活性，对皮肤真菌、毛癣菌属、曲霉属、着色真菌、隐球菌属和念珠菌属具有良好的抗菌活性。这类药物通过干扰细胞色素P-450的活性，抑制真菌细胞膜主要固醇麦角固醇的生物合成，损伤真菌细胞膜，改变其通透性，导致细胞内重要物质外漏。它们还能抑制三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和过氧化物酶的活性，引起细胞内过氧化氢的积累，导致细胞超微结构的退化和细胞坏死。这些药物对细菌也有一定的抑制作用。根据目前国内的要求，有必要对不需要灭菌的药物制剂建立微生物限度检查方法，包括抗细菌和抗真菌药物制剂。然而，由于这类药物具有很强的抗菌活性，如何消除其抗菌活性，使试验顺利进行，成为建立方法的一个极其重要和困难的关键点。本文作者选取了目前国内不适合进行微生物限度检查的吡咯类(如硝酸戊唑醇、克霉唑)抗真菌药物制剂进行实验研究。经过多次实验，重点考察和优化了洗涤液的组成和洗涤量。最后参考欧洲药典，确定以含组氨酸、卵磷脂和聚山梨酯80的混合溶液作为稀释液和洗涤液，离心沉降集菌法与膜过滤法相结合。因此，建立了硝酸戊唑醇和克霉唑药物制剂的微生物限度检查方法，并进行了方法学验证。结果表明，该方法是合理可行的。
1试剂和仪器
1.1试剂测试
三批次硝酸戊唑醇阴道乳膏、两个厂家的三批次克霉唑阴道片、三批次复方克霉唑乳膏、三批次克霉唑乳膏、三批次醋酸咪康唑乳膏均为市售药品。营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基和甘露醇氯化钠琼脂培养基均购自中国药品生物制品检定所。组氨酸、卵磷脂、聚山梨酯80、蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠都是市售分析纯试剂和试剂。金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，大肠杆菌[CMCC(B)44102]，铜绿假单胞菌[CMCC (b) 10102]。黑曲霉[CMCC(F)98003]，以上菌种均购自中国药品生物制品检定所菌种室。按照《中国药典》(2005年版)附录的要求，将上述5个验证菌株制成菌液，每1 ml含菌量为50~100 cfu。
1.2仪器
清洁工作台、医用吸引器、低速离心机等。
2方法和结果
2.1药典附录收集方法试验结果
将上述药物用《中国药典》2005年版推荐的常用稀释剂无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶10的试液，依次采用几种消除药物抑菌作用的处理方法。即培养基稀释法(取1∶10试液0.2 ml或取1∶100试液0.2 ml注入培养皿中)、离心沉降集菌法、以pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为洗涤液的膜过滤法、离心沉降集菌法与膜过滤法相结合。其中，以pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液为洗涤液，总洗涤量达到65438±0000ml。离心沉淀集菌膜过滤联合试验回收率测定结果见表1。
2.2回收率的确定
即使采用离心沉降法结合膜过滤法，5个验证菌株中仍有4个回收率为零，说明吡咯类抗真菌药物对细菌和真菌有较强的抑制作用，或者滤膜对这些药物有较强的吸附作用，目前常用的洗涤液很难洗涤，国内常用的几种处理方法也不适用于这些药物。
2.3稀释液和冲洗液不同配方的效果比较
参照中国药典(2005年版)[1]和欧洲药典(第5版)[2]，配制以下5种稀释液和冲洗液，如表2所示。
选取一批克霉唑阴道片，对上述五种稀释剂和洗涤液依次进行试验。将离心沉降和细菌收集与膜过滤相结合，并对实验效果进行了比较。详情见表3。
以上结果表明，用欧洲药典配方溶液和卵磷脂作为进口试剂，或用自制的5号溶液作为稀释液和洗涤液，消除药物的抑菌作用，均令人满意，但当卵磷脂换成国产试剂时，由于溶液浑浊，不能过滤。当卵磷脂和聚山梨酯80的用量减少到欧洲药典的一半时，溶液的澄清度不受试剂质量的影响，洗涤效果也能满足实验要求。2.4编制方法
2.4.1根据上述试验结果建立的方法，取10 g供试品，加入含无菌组氨酸-卵磷脂-聚山梨酯80的混合溶液(见配制方法)至100 ml，保持温度在45℃，摇匀，直至供试品分散均匀，制成1: 10的均匀供试品溶液。细菌、霉菌和酵母菌的计数都是通过离心沉淀和膜过滤来结合的。取1: 10原液50毫升，500转/分钟离心5分钟，取全部上清液，将上述混合液加至50毫升，3 000转/分钟离心20分钟，取底菌收集液约5毫升，将上述混合液加至50毫升，即为1: 6544。取1: 10的供试品溶液1 ml，加入到上述100 ml的混合溶液中，用薄膜过滤器全部过滤，用上述混合溶液作为洗涤液，每次洗100 ml，* * *三次，取滤膜，依法检查(中国药典)
2.4.2控制细菌(如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等。)应通过离心沉淀和薄膜过滤进行检查。取上述菌落数1: 10项下的供试品溶液10 ml，加入上述100 ml混合液中，用薄膜过滤器全部过滤。洗涤方法同菌落计数项下，将滤膜接种于相应培养基中，依法检查(中国药典2005年版附录ⅺ J)。
2.4.3无菌组氨酸-卵磷脂-聚山梨酯80混合溶液的制备方法聚山梨酯80 15 g、卵磷脂1.5 g、组氨酸0.5 g、蛋白胨0.5 g、氯化钠2.15 g、磷酸二氢钾1.8 g、磷酸氢二钠3.6 g、水65438+。
2.5验证测试
按照中国药典2005年版附录的要求，对上述建立的方法进行了验证。
2.5.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证:分别取上述5种菌液1 ml，用平板计数法测定配制好的菌液中每ml活菌数。试验对照组:取1∶10试验溶液1 ml，加入100 ml上述混合溶液，用滤膜全部过滤，同上述方法洗涤，取滤膜，在规定温度下培养，计数。试验组:取1: 10的试验溶液1 ml，操作同试验对照组。将1 ml上述菌液(50~100 cfu试验菌)加入第三次冲洗液中，取滤膜，在规定温度下培养，计数，计算回收率，见表。稀释液对照组:分别取上述五种菌液10ml(500 ~ 1000 cfu试验菌)，同对照组操作，计算回收率，见表4。根据以下公式计算回收率(%):
上述实验表明，各验证菌的回收率均符合药典附录的要求，说明用该方法对细菌、霉菌和酵母菌进行计数是可行的。
2.5.2控制菌检查法验证试验组:取上述1: 10试液10 ml，加入上述100 ml混合液中，用滤膜全部过滤，将滤膜加入相应培养基100 ml中进行增菌培养，作为供试品。空白对照组:取上述混合液65438±00ml，操作同稀释液空白对照组。阴性细菌对照组:取10 ml试液，加入上述混合液中，用滤膜全部过滤。清洗方法同上，但在第三次清洗液中加入适当的阴性对照菌(如选择大肠杆菌作为金黄色葡萄球菌检查的阴性对照菌)。阳性细菌对照组:取10 ml试液，加入上述混合液中，用滤膜全部过滤。洗涤方法同上，但第三次(10 ~ 65448)在洗涤液中加入适当的细菌(如金黄色葡萄球菌)。
以上各组均在35 ~ 37℃培养18 ~ 24 h，分别在相应培养基上划线，再在35 ~ 37℃培养18 ~ 24 h，结果阳性菌对照组生长良好，说明该类药物无抑菌作用或经此处理后其抑菌作用可忽略。未检出阴性细菌，说明控制细菌的方法是特异可行的。
3讨论
本实验研究表明，吡咯类药物对细菌和真菌均有较强的抑菌作用。对于这些抗菌活性强的药物，首先要探索消除其抑菌作用的方法，然后才能成功地检查其微生物限度。
如果采用薄膜过滤法检查药品的微生物限度，稀释液和冲洗液的种类和用量非常重要，甚至可以决定方法的适用性。作为微生物限度检查的稀释液和冲洗液，不仅应具有溶解药物的作用，还应具有维持细菌细胞膜通透性、修复受损细胞、破坏药物对细菌细胞损伤的作用。组氨酸是本实验确定的洗涤液配方中白色念珠菌生长的重要氮源之一。卵磷脂对细胞膜的修复有重要作用；聚山梨酯80作为一种表面活性剂，可以降低细菌外围与培养基接触面之间的表面张力，使外围营养物质更快地进入细胞，从而促进细菌更快地生长和进行其他活动。卵磷脂与聚山梨酯80合用可中和抑菌剂，中和产物对细菌和培养基影响很小。因此，在稀释液和洗涤液中加入这些物质，可以有效降低药物对细菌和真菌的抑制作用，促进受损细菌和真菌的生长。
部分国产试剂和试剂与进口的存在一定的质量差异。欧洲药典记载的洗涤液配方中卵磷脂和聚山梨酯80的含量较多。用国产产品配制时，溶解性不好，造成溶液浑浊。洗涤量大时，溶液过滤速度慢，影响洗涤效果，甚至无法过滤。这个问题可以通过减少配方中各组分的用量来有效解决。经验证，即使将配方中各组分的用量减半，效果仍能满足实验需要，过滤速度合适，也能降低实验成本。
[参考文献]
【1】国家药典委员会。中国药典。第二部分。北京:化学工业出版社，2005。附录93。
[2]欧洲药典。第五版。附录十六B.A377 .