普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤(1)

聚合酶链式反应(简称PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。它可以被视为一种特殊的体外DNA复制。DNA聚合酶I最早发现于1955，而更有实验价值和实用性的大肠杆菌Klenow片段是H. Klenow博士在70年代初发现的。但由于这种酶不耐高温，在高温下可以变性，所以不适合使用高温变性的聚合酶链式反应。现在用的酶(简称Taq聚合酶)是1976年从温泉的栖热菌中分离出来的。由于耐高温，是一种理想的酶，但在20世纪80年代后被广泛应用，PCR最初的原型概念是相似基因修复复制，由Kjell Kleppe博士在1971中提出。他发表了第一个简单而短暂的基因复制实验(类似于PCR的前两个循环)。今天开发的PCR是由卡里·B·穆利斯博士在1983中开发的。Mullis博士当年就职于PE公司，所以PE公司在PCR领域有着特殊的地位。穆利斯博士在1985与斋祀等人发表了第一篇相关论文。此后，PCR的应用突飞猛进，相关论文的质量可以说是其他许多研究方法无法比拟的。随后，PCR技术被广泛应用于生物学研究和临床应用，成为分子生物学研究中最重要的技术。穆利斯还获得了1993诺贝尔化学奖。

2 PCR原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的自然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由三个基本反应步骤组成:变性-退火-延伸:

(1)模板DNA的变性:将模板DNA加热到93℃左右一定时间后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增形成的双链DNA解离下来，以便与引物结合，为下一轮反应做准备；

(2)模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA加热变性为单链后，降温至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物延伸:DNA模板-引物偶联物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基互补配对和半保守复制的原理，可以合成与模板DNA链互补的新的半保守复制链，重复循环变性-退火-延伸三个过程，可以得到更多的“半保守复制链”，这个新链可以作为下一个循环的模板。完成一个循环需要2 ~ 4分钟，待扩增的目的基因在2 ~ 3小时内可扩增百万倍。

3 PCR反应体系和反应条件

3.1标准PCR反应系统

10×扩增缓冲液10μl

200μl四种dNTP的混合物。

引物10～100μl

模板DNA 0.1 ~ 2 μ g

Taq DNA聚合酶2.5微升

Mg2+1.5毫摩尔/升

添加双份或三份蒸馏水100μ l

3.2 PCR反应的五要素

参与PCR反应的物质主要有五种，分别是引物(PCR引物是DNA片段，细胞内DNA复制的引物是RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(需要Mg2+)。[[PCR步骤]

标准PCR过程分为三个步骤:

1.DNA变性(90℃-96℃):在热的作用下，双链DNA模板的氢键断裂，形成单链DNA。

2.退火(25℃-65℃):系统温度降低，引物与DNA模板结合形成局部双链。

3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下(72℃左右，活性最好)，以dNTP为原料，从引物的5’端延伸到3’端，合成一条与模板互补的DNA链。

在每个循环中的变性、退火和延伸之后，DNA含量加倍。目前有些PCR由于扩增区域很短，即使Taq酶活性不是最适，也能在短时间内复制，因此可以改为两步法，即退火和延伸在60℃-65℃同时进行，以减少一次加热和冷却过程，提高反应速度。

4 PCR反应特征

4.1具有很强的特异性。

PCR反应的特定决定因素是:

①引物和模板DNA的特异性正确组合；

②碱基配对原理；

③Taq DNA聚合酶合成反应的真实性；

④目的基因的特异性和保守性。

引物和模板的正确组合是关键。引物与模板的结合和引物链的延伸遵循碱基配对的原理。由于聚合酶合成反应的保真性和Taq DNA聚合酶的耐高温性，反应中模板和引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，扩增的目的基因片段可以保持较高的准确性。通过选择特异性高、保守的靶基因区域，其特异性会更高。

4.2高灵敏度

PCR产物量呈指数级增加，可以将待测初始模板按皮克(pg=10-12)级扩增到μg=-6的水平。可以从654.38+0万个细胞中检测出一个目标细胞；在病毒检测中，PCR的灵敏度可达3 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中，最低检出率为3个细菌。

4.3简单快捷

耐高温Taq DNA聚合酶用于PCR反应。反应液一次性加入后，在DNA扩增液和水浴锅中进行变性-退火-延伸反应，扩增反应一般在2 ~ 4小时内完成。扩增产物一般用电泳分析，不需要同位素，所以没有放射性污染，易于推广。

4.4标本纯度低。

不需要分离病毒或细菌和培养细胞，可以用粗DNA和RNA作为扩增模板。可直接用于血液、体腔液、漱口液、头发、细胞、活组织等临床标本的DNA扩增和检测。

5 PCR常见问题

5.1假阴性，无扩增带。

PCR反应的关键环节是①模板核酸的制备，②引物的质量和特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。要找到原因，也要对以上环节进行分析研究。

模板:①模板中含有蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中的蛋白质未被消除，尤其是染色体中的组蛋白，④模板的提取和制备过程中丢失过多，或吸入苯酚。⑤模板核酸没有完全变性。当酶和引物的质量良好时，没有扩增带，这很可能是由于样品的消化和模板核酸提取过程的失败。所以为了配制有效稳定的消化液，程序要固定，不能随意更改。

酶失活:需更换新酶或新旧酶同时使用，分析假阴性是否因酶活性丧失或不足所致。需要注意的是，Taq酶或溴化乙锭有时会被遗忘。

引物:引物的质量、引物的浓度、两个引物的浓度是否对称是PCR失败或扩增带不理想的常见原因，容易分散。部分批次的引物合成质量存在问题。两个引物中的一个浓度高，另一个浓度低，导致不对称扩增效率低。对策如下:①选择好的引物合成单个位置。②引物的浓度不仅取决于OD值，还取决于引物原液的琼脂糖凝胶电泳。一定要有引物带，两条引物带的亮度要大致相同。比如一个引物有带，另一个引物没有带，此时PCR可能会失败，要和引物合成单位协商解决。如果一种底漆亮度高，另一种亮度低，稀释底漆时浓度要平衡。(3)引物应高浓度小包装保存，避免引物因反复冻融或长期存放在冰箱中而变质降解。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率有很大影响。浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则会影响PCR扩增的产量，甚至使PCR扩增失败而不产生扩增带。

反应体积的变化:通常，用于PCR扩增的体积为20ul、30ul和50ul。或者100ul，PCR扩增要用哪个体积是根据科研和临床检测的不同目的来设定的。做小体积的时候，比如20ul，一定要设置好模式条件，否则很容易失败。

物理原因:变性对PCR扩增非常重要，如变性温度低、变性时间短，极易产生假阴性；过低的退火温度会导致非特异性扩增，降低特异性扩增效率。过高的退火温度会影响引物和模板的结合，降低PCR扩增效率。有时需要用标准的温度计来检测扩增器或水溶锅中的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列的变异:如果靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板的特异性结合，或者由于靶序列的某一段缺失导致引物与模板失去互补序列，其PCR扩增就不会成功。

5.2假阳性

PCR扩增条带与靶序列条带一致，有时条带更整齐、更亮。

引物设计不当:选择的扩增序列与非靶扩增序列具有同源性，因此在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物是非靶序列。如果靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。引物需要重新设计。

靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两个原因:一是全基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。这种假阳性可以通过以下方法解决:操作要小心轻柔，防止靶序列被吸入装填枪或溅出离心管。除酶和不能耐高温的物质外，所有试剂或设备都要高压灭菌。使用的离心管和进样枪头应一次性使用。必要时，在添加样品之前，用紫外线照射反应管和试剂以破坏存在的核酸。二是空气中核酸小片段的污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。它们可以相互拼接，与引物互补后，PCR产物可以扩增，产生假阳性，通过巢式PCR可以减轻或消除。

5.3出现非特异性扩增带

PCR扩增后的条带与预期大小不一致，或大或小，或特异性扩增条带和非特异性扩增条带同时出现。出现非特异性条带的原因有两个:一是引物与靶序列不完全互补，或者引物聚合形成二聚体。第二，Mg2+离子浓度过高和退火温度过低与PCR循环次数过多有关。其次是酶的质量和数量，往往某些来源的某些酶容易出现非特异性条带而另一些则不会，有时酶量过高会出现非特异性扩增。对策如下:必要时重新设计指南。减少酶的用量或从其他来源更换酶。减少引物的用量，适当增加模板的用量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用双温点法(93℃变性，65℃左右退火延伸)。

5.4出现片状牵引带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。原因往往是酶太多或酶质量差，dNTP浓度太高，Mg2+浓度太高，退火温度太低，循环次数太多。对策有:①减少酶的用量，或者换其他来源的酶。②降低dNTP浓度。③适当降低Mg2+浓度。(4)增加模板量，减少循环次数。